一种新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及新型冠状病毒核酸检测技术，具体涉及用于一种新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合及其应用，引物探针组合包括针对新型冠状病毒Delta变异株靶点设计的一对特异性扩增引物和一条特异性识别单碱基突变的检测探针，该引物和探针可与新型冠状病毒N基因和人的内标Actin基因的引物探针相组合。本发明专利技术的引物探针组合可以实现在一管反应中，同时检测样本中是否含有新型冠状病毒核酸，进一步的鉴别是否为新型冠状病毒Delta变异株。应用本发明专利技术提供的新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合，对RNA核酸样本进行检测，具有特异性好、灵敏度高，以及方便、快速、准确的特点。准确的特点。准确的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及新型冠状病毒核酸检测技术，具体涉及用于一种新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]随着新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS
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2）的不断进化和变异，相继出现多种关切变异株(Variant of concern，VOC)。其中已成为公共卫生部门和民众重点关注的VOC—新型冠状病毒Delta变异株(原称B.1.617. 2），其传播能力和致病性明显提高，并出现抗原逃逸现象，具有传播力强、感染潜伏期短、致病性强、发病进程快等特点。
[0003]针对新型冠状病毒Delta变异株的检测，现有技术中主要提供了新型冠状病毒ORF基因和/或N基因作为新型冠状病毒靶基因的检出，然后再通过二代测序技术（NGS）确定是否存在突变位点来鉴别Delta变异株，该方法准确度较高，但其存在的缺陷为该方法并非一次性检出，且成本高耗时久，故在实际应用中很不方便。

技术实现思路

[0004]为了快速有效的一步法鉴别样品中是否存在新型冠状病毒Delta变异株，本专利技术基于Taqman荧光探针法的原理技术，针对Delta变异株的突变位点，设计了特异性好、灵敏度高的引物和探针。
[0005]本专利技术用于准确检测新型冠状病毒Delta变异株，现将其靶点选择做如下说明：新型冠状病毒Delta变异株(原称B.1.617. 2）因其具有传播力强、感染潜伏期短、致病性强、发病进程快等特点，逐渐取代其他VOC成为全球疫情流行株。新型冠状病毒Delta变异株具有L452R、P681R、T19R和T478K突变，研究显示L452R突变位于SARS
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2刺突蛋白的受体结合区域，这对进入宿主细胞至关重要，且L452R突变增强了其膜融合活性、传染性和病毒复制能力。故本专利技术专利使用S蛋白上的L452R突变位点作为新型冠状病毒Delta变异株检测的靶基因（NCBI，MZ571142.1），本专利技术专利所提供的引物设计在包含L452R突变位点的保守区域，而特异性检测探针则设计在L452R突变位点上。
[0006]本专利技术提供的一种用于新型冠状病毒Delta变异株检测的探针，具有SNP分型的作用。SNP（Single Nucleotide Polymorphisms）全称为单核苷酸多态性，是指在基因组上单个核苷酸的变异，变异类型包括转换、颠换、缺失和插入。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种。目前Taqman探针法荧光定量PCR检测成为最常见的SNP分型方法之一。本专利技术将通过Taqman荧光探针法验证L452R碱基由T突变成G的SNP位点，实现L452R位点上单个碱基突变的检测。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合，其特征在于，包括一对特异性扩增引物和一条特异性识别单碱基突变的检测探针。
[0008]（1）一对特异性扩增引物，设计在包含L452R突变位点的保守区域，为有效提高目的片段的扩增效率，其设计思路为：a、首先需要扩增产物长度80～200bp之间，最佳选择80～150bp。引物长度一般在20～25bp，但不应过长，否则延伸温度变高而影响Taq DNA聚合酶进行反应；b、引物GC含量在40%~70%之间，且上下游引物的GC含量不能差异太大；c、引物自身及引物之间不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合，尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体的形成；基于以上的设计思路，设计的引物序列如下：引物组1：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的上下游引物；引物组2：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的上下游引物；引物组3：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的上下游引物；引物组4：SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示的上下游引物；引物组5：SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的上下游引物；引物组6：SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示的上下游引物；引物组7：SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示的上下游引物；引物组8：SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的上下游引物；通过综合对比序列，在以上引物组1～8中，选择上下游的Tm值均在55℃左右、GC含量在40～70%之间，上下游的Tm值和GC含量均比较相近，扩增产物长度在80～150bp之间且不易形成引物二聚体和发卡结构，对尽量满足以上条件的引物组进行排序，最终选择其中的3组引物组合用于实验筛选。
[0009]（2）一对特异性扩增引物，其序列选自以下：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的上下游引物；或SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的上下游引物；或SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的上下游引物。
[0010]（3）一对特异性扩增引物，包括优选的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，和优选的下游引物序列如SEQ ID NO.6所示。
[0011]（4）一条特异性识别单碱基突变的检测探针，其设计思路为：a、首先探针中L452R发生突变的碱基需要对整条探针与模板结合能力的影响较大，即含有突变碱基的探针会比含有正常碱基的探针的Tm值低。因此这对探针长度和SNP位点在探针中的位置有较高的要求。对应的，我们考虑探针长度选择在15～22bp之间；b、其次需要保证探针与模板的特异性扩增。考虑到整体探针Tm值的影响，通常比引物的Tm值高5
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10℃以确保探针与模板结合的稳定程度大于引物与模板结合的稳定程度，且确保GC含量在40
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60%；c、此外由于荧光基团和对应的淬灭基团分别修饰在探针的5'端和3'端，本专利选择Taqman
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MGB探针，包含一个5'端荧光报告基团染料和一个3'端非荧光淬灭剂 (NFQ)。NFQ 具有背景信号较低的优势，从而能在定量中获得更好的精度。MGB探针还可以增加探针的Tm值约10℃左右并稳定探针/靶标杂交，这意味着 TaqMan MGB 探针可以比普通探针短很多，并提供更好的序列鉴别能力和灵活性。
[0012]基于以上的设计思路，以及优选的引物组合，与其适配的探针序列设计如下：探针1：SEQ ID NO.7所示；探针2：SEQ ID NO.8所示；探针3：SEQ ID NO.9所示；探针4：SEQ ID NO.10所示；探针5：SEQ ID NO.30所示；探针6：SEQ ID NO.31所示；探针7：SEQ ID NO.32所示；探针8：SEQ ID NO.33所示；探针9：SEQ ID NO.34所示；探针10：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合，其特征在于，包括针对新型冠状病毒Delta变异株靶点设计的一对特异性扩增引物和一条特异性识别单碱基突变的检测探针，该引物和探针可与新型冠状病毒N基因和人的内标Actin基因的引物探针相组合。2.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合，其特征在于，所述一对特异性扩增引物的序列选自以下：SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；或SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；或SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物。3.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合，其特征在于，所述一对特异性扩增引物的序列为SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物。4.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合，其特征在于，核苷酸序列的Tm值比扩增引物高5～10℃，且GC含量为40%～70%。5.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合，其特征在于，所述特异性识别单碱基突变的检测探针其序列选自以下：SEQ ID NO.7所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：张严峻，
申请(专利权)人：杭州杰毅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：