一种德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法技术

本发明专利技术涉及植物组织培养技术领域，具体公开了一种德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法，包括以下步骤：（1）无菌播种；（2）增殖继代培养；（3）茎尖离体培养；（4）生根壮苗培养；（5）炼苗；（6）移栽及菌根真菌促生栽培；（7）栽培后苗期管理。本发明专利技术的德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法，建立德式兜兰非共生萌发、无性克隆组织培养快速繁殖技术体系以及高速栽培技术，德式兜兰非共生萌发无暗处理，生长周期更短；能够快速培养大量健壮的德氏兜兰种苗，种苗萌发率高、健壮、生长周期短；本方法简单易操作，生产成本低，有利于珍稀濒危野生德氏兜兰的资源保护和可持续发展，并能较好地促进兜兰产业的发展。的发展。

【技术实现步骤摘要】
一种德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法


[0001]本专利技术属于植物组织培养
，特别涉及一种德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法。

技术介绍

[0002]德氏兜兰，又称越南美人兜兰，是兰科杓兰亚科兜兰属宽瓣亚属植物，主要分布于越南、中国的广西及云南等地，其花具有香味，萼片和花瓣均呈白色，唇瓣呈深囊状，近球形，粉红色至浅紫红色，具有较高的观赏价值，是兜兰园艺育种良好的亲本材料。德式兜兰野外资源濒临灭绝，被世界自然保护联盟(IUCN)列为极危(CR)物种，目前野生植株大约仅有200株，因此亟需开展德氏兜兰种质资源保护及人工繁育工作。
[0003]德式兜兰和其他兜兰属物种一样，目前常用的繁殖方式有种子繁殖和分株繁殖两种方法，分株繁殖为传统繁殖方式，其繁殖系数低、速度慢，难以满足对野生资源保育和开发利用的需求。种子繁殖包括共生萌发(与真菌共生)和非共生萌发(无菌播种)两种，共生萌发需要特定的真菌和环境，且繁殖系数低需要的时间更长。因此，通过种子非共生萌发获得大量种苗是兜兰属植物较为常用的繁殖方式。申请号为202110156474.5中国专利公开了一种德氏兜兰种子非共生萌发的方法，采用德氏兜兰种子作为外植体，通过在特定的培养基上和光环境条件下进行播种、分化和壮苗与生根培养成苗，但是存在种子萌发率低（60d萌发率最高为47.7%），培养期间光照条件控制复杂、不同时期需要不同光源和波长，而且没有明确德氏兜兰最佳的蒴果成熟度等。德式兜兰在培育过程中和其他大多数兜兰属植物一样，试管苗发育较缓慢，难以短时间大量繁育，移栽难度较大。通过对多种不同培养基的培养试验，探索其丛生芽增殖和培育壮苗的最佳方案是快速扩大组培苗数量和促进组培苗移栽成活的重要措施。但兜兰的试管成苗过程受兜兰种类、外植体种类、培养基种类等多种条件影响。
[0004]德氏兜兰的无性组织培养与其他兜兰属植物一样，通常是以芽、叶片和根系为外植体进行繁殖，但由于外植体去污难、易褐化及增殖速度慢等原因，其无性组织培养难度极大，德式兜兰的无性克隆繁殖技术也鲜有报道。。表现优异的野生种和选育的新品种因种苗难以规模化生产而未得到大规模推广，严重影响了兜兰资源保育和产业的发展。因此，兜兰的无性克隆繁殖技术的问题亟待解决。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种德氏兜兰组织培养快速繁殖方法，通过德氏兜兰种子非共生萌发培养、原球茎增殖和分化、茎尖离体诱导培养成小苗、壮苗生根、炼苗移栽等步骤培养健壮的德氏兜兰种苗，建立德式兜兰非共生萌发及无性克隆组织培养快速繁殖技术体系。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法，包括以下步骤：
（1）无菌播种：取成熟度为180~240DAP（授粉后天数）德氏兜兰蒴果，将蒴果内种子接种到萌发培养基中进行培养，种子萌发形成原球茎；所述萌发培养基包括：1/2~1/8MS、90~110ml/L椰汁，所述萌发培养基pH为5.3~6.0；（2）增殖继代培养：将步骤（1）得到的原球茎接种到增殖分化培养基中进行培养，增殖分化形成组培苗；（3）茎尖离体培养：取步骤（2）得到组培苗的茎尖接种到诱导培养基中进行诱导培养，形成小苗；所述诱导培养基包括：1/2MS~1/4MS、90~110ml/L椰汁、25~35g/L蔗糖、5~6.5g/L琼脂、0.4~1.0mg/L噻苯隆（TDZ），所述诱导培养基的pH为5.3~6.0；（4）生根壮苗培养：将步骤（3）得到的小苗转接入生根培养基中培养成健壮小苗；（5）炼苗；（6）移栽及菌根真菌促生栽培；（7）栽培后苗期管理。
[0007]优选的，上述德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法中，所述步骤（2）中，增殖分化培养基包括：1/2~1/4MS、0.6~1.0g/L花宝1号、0.6~1.0g/L花宝2号、20~40g/L蔗糖、5~6.5g/L琼脂、1.0mg/L 6
‑
苄基腺嘌呤、0.1mg/L萘乙酸，所述增殖分化培养基的pH为5.3~5.5。
[0008]优选的，上述德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法中，所述增殖分化培养基还包括0.8~1.2g/L活性炭。
[0009]优选的，上述德氏兜兰组织培养快速繁殖方法中，所述步骤（4）中，生根培养基包括：1/2MS~1/4MS、0.6~1.1g/L花宝1号、0.6~1.1g/L花宝2号、90~110ml/L椰汁、20~40g/L蔗糖、0~1mg/L萘乙酸。
[0010]优选的，上述德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法中，所述步骤（5）中，炼苗为：当步骤（4）中的健壮小苗叶片数4~5片、叶长3.5~4.5cm时，将组培苗移至炼苗室内炼苗，炼苗室温度为15~30℃，光照强度为5000lx；炼苗10~15d后，移至栽培设施内自然条件下放置3 ~4d，然后打开封口炼苗1~2d。
[0011]优选的，上述德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法中，所述步骤（6）中，组培苗移栽及菌根真菌促生栽培包括以下步骤：
①
将经过炼苗后的小苗用清水洗净根部附着的培养基，用1000倍多菌灵或百菌清或甲基托布津溶液喷洒，在阴暗处晾干；
②
采用菌剂基质混合法栽培或菌剂灌根法栽培；所述菌剂基质混合法栽培过程为：用兰石和松树皮按2:1~1:1的体积比配制基质，基质pH为5.5～6.5，兰石粒径0.4~0.7cm，树皮粒径0.3~0.6cm；高温高压灭菌消毒处理，然后在基质中接入菌剂，菌剂与基质的体积比为1:2，充分混合使用，室温放置2~3d，分装至穴盘或塑料杯中，将步骤
①
得到的小苗种植穴盘或塑料杯，每穴（杯）种植1~2株；所述菌剂灌根法栽培包括以下步骤：将菌剂与清水按体积比1:3比例配制成菌剂悬浊液，然后将步骤
①
得到的小苗植株根部在菌剂悬浊液中浸泡1~3h，然后种植在装有兰石和松树皮按2:1~1:1的体积比配制基质的穴盘或塑料杯，每穴（杯）种植1~2株；种植3d后每植株在根部灌施5mL菌剂悬浊液，每隔10d灌施1次，共灌施3~4次。
[0012]优选的，上述德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法中，所述菌剂为镰刀菌a
‑8‑
2、角膜菌A6
‑
2中的一种或者两种，两种混合时镰刀菌a
‑8‑
2和角膜菌A6
‑
2配比为1:1。
[0013]优选的，上述德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法中，所述塑料杯外口径为5.0~6.8cm，所述穴盘为54cm
×
28cm、每盘具50穴。
[0014]优选的，上述德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法中，所述步骤（1）、（2）、（3）、（4）中，培养条件为温度(25
±
2)℃，光照强度2000~3000lx，光照时间12h/d，光源为常规日光灯。
[0015]优选的，上述德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法中，所述步骤（7）中，栽培后苗期管理包括：小苗管理、中苗管理、大苗管理；所述小苗管理包括：环本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）无菌播种：取成熟度为180~240DAP德氏兜兰蒴果，将蒴果内种子接种到萌发培养基中进行培养，种子萌发形成原球茎；所述萌发培养基包括：1/2~1/8MS、90~110ml/L椰汁，所述萌发培养基pH为5.3~6.0；（2）增殖继代培养：将步骤（1）得到的原球茎接种到增殖分化培养基中进行培养，增殖分化形成组培苗；（3）茎尖离体培养：取步骤（2）得到组培苗的茎尖接种到诱导培养基中进行诱导培养，形成小苗；所述诱导培养基包括：1/2MS~1/4MS、90~110ml/L椰汁、25~35g/L蔗糖、5~6.5g/L琼脂、0.4~1.0mg/L噻苯隆，所述诱导培养基的pH为5.3~6.0；（4）生根壮苗培养：将步骤（3）得到的小苗转接入生根培养基中培养成健壮小苗；（5）炼苗；（6）移栽及菌根真菌促生栽培；（7）栽培后苗期管理。2.根据权利要求1所述的德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法，其特征在于，所述步骤（2）中，增殖分化培养基包括：1/2~1/4MS、0.6~1.0g/L花宝1号、0.6~1.0g/L花宝2号、20~40g/L蔗糖、5~6.5g/L琼脂、1.0mg/L 6
‑
苄基腺嘌呤、0.1mg/L萘乙酸，所述增殖分化培养基的pH为5.3~5.5。3.根据权利要求2所述的德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法，其特征在于，所述增殖分化培养基还包括0.8~1.2g/L活性炭。4.根据权利要求1所述的德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法，其特征在于，所述步骤（4）中，生根培养基包括：1/2MS~1/4MS、0.6~1.1g/L花宝1号、0.6~1.1g/L花宝2号、90~110ml/L椰汁、20~40g/L蔗糖、0~1mg/L萘乙酸。5.根据权利要求1所述的德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法，其特征在于，所述步骤（5）中，炼苗过程为：当步骤（4）中的健壮小苗叶片数4~5片、叶长3.5~4.5cm时，将组培苗移至炼苗室内炼苗，炼苗室温度为15~30℃，光照强度为5000lx；炼苗10~15d后，移至栽培设施内自然条件下放置3~4d，然后打开封口炼苗1~2d。6.根据权利要求1所述的德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法，其特征在于，所述步骤（6）中，组培苗移栽及菌根真菌促生栽培包括以下步骤：
①
将经过炼苗后的小苗用清水洗净根部附着的培养基，用1000倍多菌灵或百菌清或甲基托布津溶液喷洒，在阴暗处晾干；
②
采用菌剂基质混合法栽培或菌剂灌根法栽培；所述菌剂基质混合法栽培为：用兰石和松树皮按2:1~1:1的体积比配制基质，基质pH为5.5～6.5，兰石粒径0.4~0.7cm，树皮粒径0.3~0.6cm；高温高压灭菌消毒处理，然后在基质中接入菌剂，菌剂与基质的体积比为1:2，充分混合得到带菌基质，室温放置2~3d，将带菌分装至穴盘或塑料杯中，将步骤
①
得到的小苗种植穴盘或塑料杯；所述菌剂灌根法栽培包括以下步骤：将菌根制剂与清水按体积比1:3比例配制成菌剂悬浊液，然后将步骤
①
得到的小苗植株根部在菌剂悬浊液中浸泡1~3h，然后种植在装有兰石和松树皮按2:1~1:1的体积比配制得到的基质的穴盘或塑料杯；种植3d后每植株在根部灌施5mL菌剂悬浊液，每隔10d灌施1次，共灌施3~4次。
7.根据权利要求6所述的德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法，其特征在于，所述菌剂为镰刀菌a
‑8‑
2、角膜菌A6
‑
2中的一种或者两种。8.根据权利要求1所述的德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）、（3）、（4）中，培养条件为温度(25
±
2)℃，光照强度2000~3000lx，光照时间12h/d，光源为常规日光灯。9.根据权利要求6所述的德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法，所述步骤（7）中，栽培...

【专利技术属性】
技术研发人员：李秀玲，廖宏英，范继征，王晓国，卜朝阳，何荆洲，曾艳华，王丰顺，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：