醉茄素A在制备黑色素瘤治疗药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了醉茄素A在制备黑色素瘤治疗药物中的应用，属于生物医药技术领域。醉茄素A作为黑色毒瘤治疗药物能够明显缓解尾静脉接种的黑色素瘤肺部转移的现象。本发明专利技术首次发现醉茄素A在抑制黑色素瘤转移中的作用，由于其无毒无副作用，因而可单独或联合其它抗肿瘤药物作为防治黑色素瘤的化疗手段。物作为防治黑色素瘤的化疗手段。物作为防治黑色素瘤的化疗手段。

【技术实现步骤摘要】
醉茄素A在制备黑色素瘤治疗药物中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及醉茄素A在制备黑色素瘤治疗药物中的应用。

技术介绍

[0002]黑色素瘤是一种高度侵袭性皮肤癌，虽然其发生率仅占皮肤癌病例的4%，但致死率占皮肤癌死亡人数的75%。尽管我国恶性黑色素瘤的发病率低于欧美国家，但是近20年来其发病率一直在增加，大多数黑色素瘤患者被诊断为局部晚期疾病，预后不佳。在晚期黑色素瘤的治疗中化疗（如达卡巴嗪等）可延长患者生存期，但是，黑色素瘤对传统化疗具有较强的抵抗力。针对黑色素瘤中存在的分子突变缺陷（包括BRAF抑制剂维莫非尼和达拉菲尼）采取的靶向疗法，对大部分BRAF突变黑色素瘤患者非常有效，但患者会在相对较短的时间内产生继发性耐药。转移性黑色素瘤目前相对有效的治疗方法是免疫检查点抑制剂，例如：抗CTLA
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4抗体伊匹单抗和两种抗PD
‑
1抗体纳武单抗和派姆单抗。然而抑制剂可诱导自身细胞耐受产生相应的并发症和较为严重的副作用（皮肤、胃肠系统和内分泌器官的免疫相关炎症）。因此，如何有效克服继发性耐药及副作用的问题亟待解决，研究开发安全有效的黑色素瘤治疗药物迫在眉睫。
[0003]醉茄素A（Withaferin A，WA），是从醉茄中提取的主要有效成分，具有免疫调节、抗氧化、抗血糖、抗心肌再灌注损伤及治疗治疗COVID
‑
19等功效，目前也有越来越多的研究发现醉茄素A在肿瘤防治过程中也发挥着巨大的潜力，但是其在转移性黑色素瘤中的作用目前尚未有报导。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供醉茄素A在制备黑色素瘤治疗药物中的应用。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：醉茄素A在制备黑色素瘤治疗药物中的应用。
[0006]给药方式为腹腔给药方式，所述药物有效剂量范围为1
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8mg/kg，优选4mg/kg。
[0007]所述醉茄素A在细胞水平上的剂量范围为0.5
‑
2μM，优选1μM。
[0008]所述醉茄素A作为黑色毒瘤治疗药物能够明显缓解尾静脉接种的黑色素瘤肺转移的现象，小鼠肺部黑色素瘤结节（数目、大小），肺组织病理HE染色等实现其体内对转移性黑色素瘤防治的评估。
[0009]所述醉茄素A通过抑制黑色素瘤细胞的迁移，进而实现对转移性的黑色素瘤的治疗。
[0010]醉茄素A在制备抑制黑色素瘤转移药物中的应用。
[0011]本专利技术首次发现醉茄素A在抑制黑色素瘤转移中的作用，由于其无毒无副作用，因而可单独或联合其它抗肿瘤药物作为防治黑色素瘤的化疗手段。
附图说明
[0012]图1为醉茄素A对B16F10细胞运动能力的实验结果。
[0013]图2 为醉茄素A对A375细胞运动能力的实验结果。
[0014]图3为醉茄素A对B16F10细胞侵袭迁移能力的实验结果。
[0015]图4 为醉茄素A对A375细胞侵袭迁移能力的实验结果。
[0016]图5为醉茄素A对B16F10细胞肺转移的实验结果。
[0017]图6为醉茄素A对小鼠心（Heart）、肝（Liver）、脾（Spleen）、肾（Kidney）的影响。
具体实施方式
[0018]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
[0019]实施例1划痕修复实验分别取对数生长期的黑色素瘤细胞B16F10、A375接种于6孔板，次日待细胞贴壁且密度达70%
‑
80%，使用200
µ
L无菌枪头在单细胞表面层进行细胞划线。
[0020]划痕后，无菌PBS洗细胞3次，给药醉茄素A于B16F10细胞1 μM和0.5 μM，给药醉茄素A于A375细胞0.5 μM和0.25 μM，且该实验采用无血清培养基。放入培养箱培养24 h。培养24 h期间在0 h、6 h、12 h、24 h各取出细胞，于显微镜下观察并拍照细胞划痕的愈合情况。使用image J软件计算细胞划痕之间的距离面积，计算细胞迁移效率。
[0021]如图1和图2（Scale bar: 200 μm）所示，与溶剂组相比，随着醉茄素A浓度增加，B16F10和A375细胞划痕愈合能力显著下降。说明醉茄素A可明显抑制黑色素瘤B16F10和A375细胞迁移能力且存在剂量依赖性。
[0022]实施例2Transwell小室侵袭实验将Matrigel铺在Transwell小室内微孔滤膜上，放至培养箱活化1小时。分别取对数生长期的B16F10细胞、A375细胞用无血清培养基稀释成浓度为 5
×
106个/mL的细胞悬液。将活化的小室置于24孔板中，取400 μL含有对应浓度醉茄素A（B16F10细胞：1 μM和0.5 μM；A375细胞：0.5μM和0.25 μM）的细胞悬液缓慢均匀滴加入Transwell小室上室内，B16F10细胞选取醉茄素A的药物浓度分别为1和0.5 μM；A375细胞选取醉茄素A的药物浓度分别为0.5和0.25 μM。下室加入600 μL含有30%血清的培养基，放入培养箱培养 24 h。24 h后取出小室，用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，100%甲醇固定2 min，0.5%结晶紫染色30 s，用纯水冲去浮色，置于显微镜下观察。随机选取上、下、左、右、中五个视野，计算迁移细胞平均数。
[0023]如图3和4（Scale bar: 200 μm）所示，随着醉茄素A浓度的增加，B16F10和A375细胞穿过Transwell小室聚碳酯底膜的能力逐渐下降，减弱细胞迁移的能力；Transwell侵袭实验在小室内加入模拟细胞外基质的Matrigel，实验结果证明B16F10和A375细胞降解Matrigel基底膜能力随醉茄素A剂量增加而降低，降低细胞侵袭的能力。以上结果表明，醉
茄素A抑制黑色素瘤B16F10和A375细胞迁移侵袭能力，且药效具有剂量依赖性。
[0024]实施例3构建C57BL/6J鼠尾静脉接种B16F10细胞肺转移模型取对数生长期的B16F10细胞消化后，用PBS洗涤细胞两次以去除残留血清。细胞计数板进行细胞计数，用预冷的PBS稀释至细胞浓度2.25
×
106个/mL。将细胞悬液置于冰上，吹悬混匀后，每只鼠尾静脉接种200
ꢀµ
L的B16F10细胞悬液。将接种的实验鼠随机分为三组： 溶媒组；醉茄素A（WA） 4mg/kg给药组；醉茄素A（WA） 8mg/kg给药组。尾静脉接种隔天开始给予醉茄素A（WA）治疗，隔天腹腔(Intraperitoneal, i.p.)给药，并测量记录小鼠体重变化，期间共计25天。实验过程如图5A所示。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.醉茄素A在制备黑色素瘤治疗药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：醉茄素A抑制黑色素瘤细胞的迁移。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为醉茄素A与药学领域常规辅料复配制成的复方制剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：强磊，王晓萍，韩超，高悦，马小奇，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：