一种基因编辑的方法技术

本发明专利技术提供了一种基因编辑的方法，所述的方法包括将包含外源基因的安全港位点载体、sgRNA载体和Cas载体共转染至宿主细胞。本发明专利技术还提供了一种SEQ ID NO：2所示的Cas载体，其与现有载体相比，具有更高的基因编辑效率。具有更高的基因编辑效率。具有更高的基因编辑效率。

【技术实现步骤摘要】
一种基因编辑的方法


[0001]本专利技术涉及一种基因编辑的方法，具体涉及采用新研发的Cas载体优化CRISPR/Cas9基因编辑方法，对猪进行基因编辑。

技术介绍

[0002]转基因技术目前已被广泛用于生物生产、药物筛选和治疗等多个方面，但通常采用的病毒转染或转座子系统会导致随机和多拷贝插入，导致转基因表达的不稳定，并可能干扰内源基因的表达，且不可能达到纯合插入，导致外源基因较难稳定地遗传。
[0003]将外源基因插入基因组的特定位点需要采用基因编辑技术，该技术是近年来发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因敲入到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑手段，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动植物及微生物的转基因中。
[0004]将外源基因稳定整合到基因组的安全港位点是目前较好的解决方案。例如，专利CN111088282A公开了AAVS1、H11安全港位点在重组表达蛋白中的应用，即利用人基因组上的AAVS1、H11位点作为整合位点高表达重组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑的方法，其特征在于，所述的方法包括将包含外源基因的安全港位点载体、sgRNA载体和Cas载体共转染至宿主细胞，其中，所述的Cas载体包含编码Cas蛋白、EGFP和Puro蛋白的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Cas载体还包含EF1a启动子、WPRE元件和3
’
LTR序列元件，优选的，所述的Cas载体的核苷酸序列从5
’-3’
依次为：CMV增强子、EF1a启动子、核定位信号、核定位信号、编码Cas蛋白的核苷酸序列、核定位信号，核定位信号、编码自剪切多肽P2A的核苷酸序列、编码EGFP的核苷酸序列、编码自裂解多肽T2A的核苷酸序列、编码Puro蛋白的核苷酸序列、WPRE序列元件、3
’
LTR序列元件和polyA信号序列元件，其中，所述的Cas蛋白选自Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t,Cas5h,Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csy4、Csel、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5e、Cscl、Csc2、Csa5、Csnl、Csn2、Csml、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、CsxlO、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、CsxlS、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Csdl、Csd2、Cstl、Cst2、Cshl、Csh2、Csal、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、C2cl、C2c2、C2c3、Cpfl、CARF、DinG、其同源物或其修饰形式，优选为Cas9。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的Cas载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的方法包括将包含外源基因的安全港位点载体、sgRNA载体和Cas载体共转染至宿主细胞中，使安全港位点载体上的外源基因分别整合入ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1任一个或两个以上安全港位点，优选的，ROSA26安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，AAVS1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，H11安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，COL1A1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA载体包含靶向ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点的sgRNA，其中，靶向ROSA26的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：45-48任一所示，靶向AAVS1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：49-52任一所示，靶向H11的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：53-56任一所示，靶向COL1A1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：57-60任一所示。6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的安全港位点载体包含与ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点5
’
端同源的5
’
同源臂和/或3
’
端同源的3
’
同源臂，优选的，还包含绝缘子区域、EF-1α启动子，编码EGFP蛋白的核苷酸序列，EF-1αpoly(A)信号序列,PGK启动子，编码mCherry蛋白的核苷酸序列，bGH poly(A)信号序列，loxP-puro-loxP表达框区域，pCAG启动子，和/或β-globin poly(A)信号序列，进一步优选的，ROSA26安全港位点载体如SEQ ID NO：4所示，AAVS1安全港位点载体如SEQ ID NO：5所示，H11安全港位点载体如SEQ ID NO：6所示，COL1A1安全港位点载体如SEQ ID NO：7所示；优选的，所述的外源基因的核苷酸序列位于安全港位点5
’
同源臂与3
’
同源臂之间。7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的安全港位点载体、sgRNA载体或Cas载体均为环状质粒。8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，曾为俊，马翔，王磊，程锐，黄彩云，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：