减轻FKRP心脏毒性的基因治疗表达系统技术方案

本发明专利技术涉及用于全身施用的表达系统，其包含编码FKRP蛋白的序列，和：

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】减轻FKRP心脏毒性的基因治疗表达系统


[0001]本专利技术基于FKRP(Fukutin相关蛋白)转基因表达的心脏毒性的鉴定。它提供了一种用于减轻心脏中FKRP毒性的表达系统，特别是通过调节，即部分去靶向(detarget)FKRP心脏表达。然后，它为与FKRP缺陷相关的各种疾病(例如肢带型肌营养不良症2I型(LGMD2I)、新命名的肢带型肌营养不良症R9型(LGMD2 R9))的治疗提供了有价值且安全的治疗工具。

技术介绍

[0002]“肌营养不良蛋白聚糖病(Dystroglycanopathies)”对导致α
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肌营养不良蛋白聚糖(α
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dystroglycan,αDG)的继发性异常糖基化的不同遗传病理进行了重新组合。这种蛋白质主要存在于骨骼肌、心脏、眼睛和脑组织中，是一种高度糖基化的膜蛋白，糖基化过程将其在肌肉中的重量从70kDa提高到156kDa。它是肌营养不良蛋白
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糖蛋白复合物的一部分，将细胞骨架连接到细胞外基质(ECM)。其高糖基化水平使αDG能够直接与一些ECM蛋白(例如心肌和骨骼肌中的层粘连蛋白、神经肌肉接头处的集聚蛋白(agrin)和基底膜蛋白多糖(perlecan)、大脑中的神经粘联分子(neurexin)和视网膜中的皮卡丘素(pikachurin))的层粘连蛋白球状结构域结合。αDG的糖基化是一种尚未完全了解的复杂过程。事实上，许多基因已被鉴定为参与αDG糖基化。由于使用高通量测序方法对显示αDG糖基化缺陷的患者进行突变检测，这些发现最近得到了加速。其中一种蛋白质是Fukutin相关蛋白(FKRP)。它最初被归类为推定的αDG糖基转移酶，因为它的序列中存在许多糖基转移酶共有的DxD基序，以及在FKRP基因突变的患者中存在αDG低糖基化的证据(Breton等人，1999；Brockington等人，2001)。最近，FKRP及其同源物fukutin被鉴定为核糖醇
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磷酸(Rbo5P)转移酶，形成添加配体结合部分所必需的di
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Rbo5P接头(Kanagawa等人，2016)。
[0003]从肢带型肌营养不良症2I型(LGMD2I；Muller等人，2005；新名称：肢带型肌营养不良症R9型或LGMD2 R9)、先天性肌营养不良症1C型(MDC1C；Brockington等人，2001)到Walker
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Warburg综合征(WWS)和肌肉
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眼
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脑病(MEB；Beltran
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Valero de Bernabe等人，2004)，FKRP基因中的突变可以产生由αDG糖基化缺陷导致的全部病理范围。疾病严重程度与患者数量呈负相关，越严重，患者越少(患病率见www.orphanet.fr:WWS(all genes):1
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9/1,000,000and LGMD2I:1
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9/100,000)。病理类型似乎至少部分与FKRP突变的性质相关。特别是，在蛋白质的276位用异亮氨酸替换亮氨酸的纯合L276I突变总是与LGMD2I相关(Mercuri等人，2003)。LGMD2I是一种隐性常染色体肌营养不良症，虽然不均一，但优先影响肩部和骨盆带的肌肉。它是欧洲最常见的LGMD2之一，特别是由于北欧L276I突变的高患病率(Sveen等人，2006)。病理的严重程度非常不均一。肌肉症状可能出现在1
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30岁之间，从杜兴氏样病到相对良性的病程不等。心脏也可能受到严重心力衰竭和死亡等后果的影响(Muller等人，2005)。使用心脏磁共振成像的研究表明，非常高比例的LGMD2I患者(60
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80％)会出现心肌功能障碍，例如射血分数降低(Wahbi等人，2008)。有趣的是，心脏异常的严重程度与骨骼肌受累无关。基于7名患者的队列，Rosales等人(2011)得出结论，LGMD2I通
常会导致轻微的结构和功能性心脏异常，尽管可能会出现严重的扩张型心肌病(一名患者)。Petri等人(2015)还观察到，在LGMD2患者中，LGMD 2I型患者(n＝28)的LVEF(左心室射血分数)从59％(15
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72)显著下降至55％(20
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61)，p＝0.03，即每年下降0.4％，并且LVEF≤50％与该亚组中死亡率增加相关。
[0004]Gicquel等人(Hum Mol Genet,2017Mar 3.doi:10.1093/hmg/ddx066)报道了FKRP
L276I
小鼠模型的产生，其中评估了置于结蛋白启动子和β
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血红蛋白(HBB2)基因的多聚腺苷酸化(polyA)信号的控制下的鼠Fkrp基因的重组腺相关病毒(rAAV2/9)转移。在肌肉内或静脉内递送后，观察到肌肉病理的改善。它们在mRNA和蛋白质水平上获得了FKRP的强表达，并显示了αDG适当糖基化的拯救和层粘连蛋白结合的增加，这导致了营养不良症的组织学和功能性拯救。如在WO2019/008157中所报道的，该构建体的肌肉效率仍然可以通过使用具有突变的FKRP编码序列来提高，从而避免由移码起始密码子产生的补充转录物。
[0005]因此，基于FKRP的基因替代疗法似乎是对FKRP缺陷引起的病理的一种有希望的治疗。然而，仍然需要安全有效的治疗。
[0006]关于基因疗法，安全表达系统被定义为确保在靶组织中产生治疗有效量的蛋白质的表达系统，即在需要所述蛋白质以治愈与天然蛋白质缺陷相关的异常的组织中，而没有任何毒性，特别是在基本和重要的器官或组织中。
[0007]例如，关于神经肌肉疾病，WO2014/167253报道了编码肌微管素(myotubularin)和钙蛋白酶(calpain)3的表达系统在全身施用时具有心脏毒性，而通过在所述构建体中引入在心脏中表达的miRNA的靶序列或通过使用在心脏中呈现毒性上可接受的水平的启动子活性或甚至没有活性的启动子序列可以减轻所述毒性。

技术实现思路

[0008]本专利技术旨在通过提供一种确保在靶组织(主要是骨骼组织)中产生治疗有效量的蛋白质并在心脏中产生毒性上可接受的量的蛋白质的表达系统来减轻或治愈与fukutin相关蛋白(FKRP)缺陷相关的破坏性病理，如肢带型肌营养不良症2I型(LGMD2I)。
[0009]实际上，专利技术人已经检测到编码FKRP的表达系统的潜在心脏毒性。这是意料之外的，因为患有与fukutin相关蛋白(FKRP)缺陷相关的病理的患者，例如肢带型肌营养不良症2I型(LGMD2I)也经常表现出心脏异常。因此，根据常识，心脏中持续水平的FKRP表达被认为是有益的，特别是减轻FKRP相关疾病的心脏症状。
[0010]值得注意的是，提供了候选基因和相关病理的列表的文件WO2014/167253对FKRP完全没有提及。另一方面，文件WO2016/138387仅提到了FKRP的推定肝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于全身施用的表达系统，所述表达系统包含编码FKRP蛋白的序列，和：
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允许在骨骼肌中以治疗上可接受的水平表达FKRP的启动子序列和在心脏中表达的miRNA的靶序列；或
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允许在骨骼肌中以治疗上可接受的水平表达FKRP并在心脏中以毒性上可接受的水平呈现启动子活性的启动子序列。2.根据权利要求1所述的表达系统，其中所述FKRP蛋白具有序列SEQ ID NO:5。3.根据权利要求1所述的表达系统，其中所述编码FKRP蛋白的序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸1659至3146，或由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸1659至3146组成。4.根据权利要求1至3中任一项所述的表达系统，其中所述表达系统包含至少一个miR208a的靶序列。5.根据权利要求4所述的表达系统，其中所述miR208a的靶序列具有序列SEQ ID NO:2。6.根据权利要求1至5中任一项所述的表达系统，其中所述表达系统包含结蛋白启动子，有利地具有序列SEQ ID NO:6。7.根据权利要求6所述的表达系统，其中所述表达系统包含SEQ ID NO:3的核苷酸146至3946或SEQ ID NO:4的核苷酸146至3974，或由SEQ ID NO:3的核苷酸146至3946或SEQ ID NO:4的核苷酸146至3974组成。8.根据权利要求1至5中任一项所述的表达系统，其中所述表达系统包...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃弗利娜，
申请(专利权)人：埃夫里瓦尔德艾松大学国家健康与医学研究院，
类型：发明
国别省市：