病毒载体生产的效价测定制造技术

本公开提供用于确定由重组病毒载体编码的有效载荷的效价的灵敏且稳健的测定。特别地，本公开提供确定由用于治疗脊髓性肌萎缩的重组病毒载体表达的SMN多肽的效价的测定。本说明书尤其包括用于确定重组病毒载体的效价(例如，生物活性)，例如相对效价的方法。例如相对效价的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】病毒载体生产的效价测定
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年8月8日提交的美国临时申请号62/884,252的优先权，所述美国临时专利申请以引用的方式整体并入本文。

技术介绍

[0003]病毒载体介导的基因治疗是一个快速发展的治疗领域。在用作治疗之前，将需要评估治疗性病毒载体的许多方面以确定安全性和功效。
[0004]因此，仍然需要用于确定重组病毒载体的效价的改进方法。特别地，需要允许改进对由重组病毒载体表达的有效载荷(例如多肽)的效价的确定的方法。

技术实现思路

[0005]本说明书尤其包括用于确定重组病毒载体的效价(例如，生物活性)，例如相对效价的方法。与用于确定由重组病毒载体表达的有效载荷(例如，多肽，诸如SMN多肽)的效价的现有方法相比，本文所述的方法具有改进的特征。在一些实施方案中，相对于相同类型的未修饰的参考宿主细胞，使用具有降低的至少一种有效载荷(例如，至少一种SMN多肽)的表达的修饰的宿主细胞允许改进本文所述的重组病毒载体的效价测定。在一些实施方案中，与其他类型的宿主细胞(例如，原代细胞和/或非人哺乳动物细胞，例如，小鼠细胞)相比，本文所述的方法中使用的修饰的宿主细胞(例如，人修饰的宿主细胞，例如SH
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SY5Y KD细胞)更具生理学相关性和/或更易于培养。在一些实施方案中，SH
‑
SY5Y KD细胞包含SMN基因(例如，SMN1或SMN2基因)中的敲低(例如，组成型或条件型)，例如，包含或表达针对SMN基因(例如，SMN1或SMN2基因)的抑制性核酸，例如针对SMN1的shRNA(例如，针对SMN1基因的强力霉素诱导型shRNA，例如shRNA120或shRNA 128)。
[0006]此类改进的特征可以包括但不限于：(i)该方法可在完全不使用辅助功能(例如Ad2或Ad5辅助病毒)的情况下进行；(ii)与用相同类型或不同类型的未修饰的参考宿主细胞进行转导相比，转导可能需要较低量的重组病毒载体；(iii)该方法具有低标准偏差；(iv)可以约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的准确度确定效价；(v)可以约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的精确度确定效价；(vi)该方法可以表明本文所述的重组病毒载体的稳定性，例如在重组病毒载体的热应激之后；(vii)本文所述的重组病毒载体的效价不受空衣壳存在的影响；以及/或(viii)能够由于选择修饰的宿主细胞系(例如，包含SMN基因(例如，SMN1或SMN2基因)中的敲低(例如组成型或条件型)的SH
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SY5Y KD细胞，例如，包含或表达针对SMN基因(例如，SMN1或SMN2基因)的抑制性核酸，例如，针对SMN1的shRNA(例如，针对SMN1基因的强力霉素诱导型shRNA，例如，shRNA120或shRNA 128))而实现高信噪比。
[0007]在一方面，本公开提供了确定编码至少一种SMN多肽的重组病毒载体的效价的方法，所述方法包括：(a)用重组病毒载体转导修饰的宿主细胞，其中修饰的宿主细胞包含相对于相同类型的未修饰的参考宿主细胞降低的至少一种SMN多肽的表达；(b)使修饰的宿主
细胞与用于检测SMN多肽的第一剂接触；(c)使修饰的宿主细胞与包含用于检测第一剂的检测部分的第二剂接触；以及(d)检测螺旋体双子(GEM)的存在，从而确定至少一种SMN多肽的效价。
[0008]在一些实施方案中，重组病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体包括慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。在一些实施方案中，AAV载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其变体。在一些实施方案中，AAV载体包括AAVhu68。在一些实施方案中，AAV载体包含与鸡
‑
β肌动蛋白启动子(CB7)可操作地连接的SMN1基因。在一些实施方案中，AAV载体包含位于SMN1基因的两个ITR。在一些实施方案中，AAV载体包含兔β
‑
球蛋白polyA信号。
[0009]在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包含SMN1基因的条件性敲低或敲除。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包含至少一种用于条件性敲低SMN1基因的shRNA。在一些实施方案中，至少一种shRNA：(i)包括shRNA120或shRNA 128，并且/或(ii)不靶向或影响本文所述的重组病毒载体。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包括或者是哺乳动物宿主细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包括或者是人类细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包括或者是SH
‑
SY5Y细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞包括或者是SH
‑
SY5Y KD细胞。
[0010]在一些实施方案中，在转导之前，进行以下中的一项或多项：(i)将宿主细胞冷冻和解冻至少一次；(ii)将修饰的宿主细胞至少传代3次；(iii)用强力霉素处理宿主细胞(例如，以诱导SMN基因的敲低)；并且/或(iv)以约5.0
×
103至约5.0
×
104个细胞/孔的密度接种宿主细胞。
[0011]在一些实施方案中，修饰的宿主细胞在24小时内被接种并转导。在一些实施方案中，转导步骤在通过连续稀释获得的约5种不同MOI下进行。在一些实施方案中，转导步骤(b)以约6.1
×
105VG/细胞至约4
×
106VG/细胞(例如约6.1
×
105VG/细胞、约9.8
×
105VG/细胞、约1.6
×
106VG/细胞、约2.5
×
106VG/细胞和约4
×
106VG/细胞)的MOI进行。在一些实施方案中，信噪比大于或为约2.5。
[0012]在一些实施方案中，第一剂包含抗SMN1抗体或其抗原结合片段或适体。在一些实施方案中，检测部分包含或者是荧光、比色或酶标记。在一些实施方案中，第二剂包含荧光标记的二级抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，通过免疫荧光检测GEM的存在。在一些实施方案中，通过成像检测GEM的存在。在一些实施方案中，成像包括或者是高内涵成像(HCI)。
[0013]在一些实施方案中，本文所述的方法在不使用或基本上不使用至少一种辅助功能的情况下进行。在一些实施方案中，至少一种辅助功能包括Ad2或Ad5辅助病毒。
[0014]在一些实施方案中，与用相同类型或不同类型的未修饰的参考宿主细胞进行转导相比，转导需要较低量的重组病毒载体。在一些实施方案中，本文所述的方法具有低标准偏差。
[0015]在一些实施方案中，以约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的准确度确定效价。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种确定编码至少一种SMN多肽的重组病毒载体的效价的方法，所述方法包括：(a)用所述重组病毒载体转导修饰的宿主细胞，其中所述修饰的宿主细胞包含相对于相同类型的未修饰的参考宿主细胞降低的所述SMN多肽的表达；(b)使所述修饰的宿主细胞与用于检测所述SMN多肽的第一剂接触；(c)使所述修饰的宿主细胞与包含用于检测所述第一剂的检测部分的第二剂接触；以及(d)检测螺旋体双子(GEM)的存在，从而确定所述至少一种SMN多肽的效价。2.如权利要求1所述的方法，其中所述重组病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。3.如权利要求2所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包括慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。4.如权利要求2所述的方法，其中所述AAV载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其变体。5.如权利要求4所述的方法，其中所述AAV载体包括AAVhu68。6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述AAV载体包含与鸡
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β肌动蛋白启动子(CB7)可操作地连接的SMN1基因。7.如权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含侧接所述SMN1基因的两个ITR。8.如权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含兔β
‑
球蛋白polyA信号。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述修饰的宿主细胞包含SMN1基因的条件性敲低或敲除。10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述修饰的宿主细胞包含用于条件性敲低SMN1基因的至少一种shRNA。11.如权利要求9所述的方法，其中所述至少一种shRNA：(i)包括shRNA 120或shRNA 128；并且/或(ii)不靶向所述重组病毒载体。12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述修饰的宿主细胞包括或者是哺乳动物宿主细胞。13.如权利要求12所述的方法，其中所述修饰的宿主细胞包括或者是人类细胞。14.如权利要求13所述的方法，其中所述修饰的宿主细胞包括或者是SH
‑
SY5Y细胞。15.如权利要求14所述的方法，其中所述修饰的宿主细胞包括或者是SH
‑
SY5Y KD细胞。16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，在转导之前，进行以下中的一项或多项：(i)将宿主细胞冷冻和解冻至少一次；(ii)将宿主细胞至少传代3次；...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：生物基因麻省公司，
类型：发明
国别省市：