造礁石珊瑚共生虫黄藻藻种及其分离纯化方法、培养方法技术

本发明专利技术涉及海洋生物学中珊瑚共生藻研究领域，特别涉及造礁石珊瑚共生虫黄藻藻种及其分离纯化方法、培养方法。本发明专利技术根据珊瑚与虫黄藻共生的特点和相应生理机制，针对性地对珊瑚体内的虫黄藻进行了分离，纯化和体外培养，根据其紧密地共生关系，在培养初期不进行杂质的去除，以保证藻体能逐渐适应体外培养的环境，在进入指数增长期后，再进行分离纯化，得到了纯净的造礁石珊瑚共生虫黄藻藻种。本发明专利技术的研究成果为推进虫黄藻生理功能，珊瑚与虫黄藻共生关系的研究，为保护珊瑚礁生态系统，提供切实可行的思路。切实可行的思路。

【技术实现步骤摘要】
造礁石珊瑚共生虫黄藻藻种及其分离纯化方法、培养方法


[0001]本专利技术涉及海洋生物学中珊瑚共生藻研究领域，特别涉及造礁石珊瑚共生虫黄藻藻种及其分离纯化方法、培养方法。

技术介绍

[0002]虫黄藻是一种广泛共生于珊瑚、砗磲、海绵等海洋无脊椎动物中的单细胞甲藻。在珊瑚礁生态系统中，这种互惠共生的关系是珊瑚礁生态系统的基础，是珊瑚生理生命活动的重要组成部分。虫黄藻自身的光合作用可以为珊瑚提供氧气，同时固定的碳被转移到珊瑚体内合成生命活动所需的各种物质。作为交换，珊瑚可以为虫黄藻提供保护，并提供给虫黄藻相应的代谢产物作为光合作用的原材料。这种合作关系使得珊瑚能够更好的适应在寡营养水体中生存。然而，这种共生关系又非常容易被破环，微小的环境变化就可能导致虫黄藻的流失或色素的破坏，从而导致珊瑚白化，甚至死亡。因此，对于虫黄藻的研究成为了珊瑚研究和保护的重要一环，但由于自然状态下的虫黄藻与珊瑚紧密共生，其相关研究难以展开，受各种因素干扰较大。
[0003]虫黄藻包含多个系群，目前，研究较为深入的是主要共生于砗磲体内的E系群(Effrenium)，已经实现了分离和体外大规模培养(张跃环等，2018)。但对于广泛共生于造礁石珊瑚体内的A、B、C、D等系群，到2014年，全球范围内仅仅有一株珊瑚虫黄藻实现了离体培养，且仅限于实验室培养阶段(Lin等，2014)。因此，对珊瑚内共生虫黄藻进行分离和体外培养能够降低虫黄藻相关研究的难度，切实推进虫黄藻生理功能，珊瑚与虫黄藻共生关系的研究，为保护珊瑚礁生态系统，提供切实可行的思路，具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提供了造礁石珊瑚共生虫黄藻藻种及其分离纯化方法、培养方法，为推进虫黄藻生理功能，珊瑚与虫黄藻共生关系的研究，为保护珊瑚礁生态系统，提供切实可行的思路。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]第一方面，本专利技术提供了造礁石珊瑚共生虫黄藻藻种，其保藏编号为：CGMCC 23075。
[0007]第二方面，本专利技术还提供了所述造礁石珊瑚共生虫黄藻藻种在珊瑚与虫黄藻共生关系的研究、珊瑚生理学研究或生态保护中的应用。
[0008]第三方面，本专利技术还提供了所述造礁石珊瑚虫黄藻藻种的分离纯化方法，包括如下步骤：
[0009]步骤1：获得珊瑚组织，与缓冲液混合研磨，获得原始悬浊液；
[0010]步骤2：取所述原始悬浊液镜检，确定所述原始悬浊液含有游离的单胞藻；
[0011]步骤3：取所述原始悬浊液接种于F/2培养基中，于6000lx光照，26℃，30转/min低速振荡培养10～15天，得到指数增长期藻液；
[0012]步骤4：取所述指数增长期藻液镜检，待有鞭毛的游动个体后，进行稀释分离，即用毛细管吸取单个藻分别放入装有200μL的F/2培养基的1.5mL离心管中，吸取30次以上，获得稀释分离的至少30个单胞藻种；
[0013]步骤5：6000lx光照，26℃，可静置培养3～5天。镜检有分裂的细胞，并且无原生动物等。
[0014]步骤6：取所述单胞藻培养管中全部转入3mL的玻璃试管中，并改用无菌小棉塞塞紧管口，期间每天添加20微升新鲜培养基。6000lx光照，26℃，30转/min低速振荡培养继续培养5～7天。镜检浓度度可达到上百个/毫升，且无原生动物。
[0015]步骤7：得到纯净的虫黄藻藻液，逐级扩增，用于下一步实验或生产。接种比例按藻液：F/2培养基＝1：1～1：2。
[0016]第四方面，本专利技术还提供了所述造礁石珊瑚虫黄藻藻种的体外培养方法，包括如下步骤：
[0017]步骤1：获得珊瑚组织，与缓冲液混合研磨，获得原始悬浊液；
[0018]步骤2：取所述原始悬浊液镜检，确定所述原始悬浊液含有游离的单胞藻；
[0019]步骤3：取所述原始悬浊液接种于F/2培养基中，于6000lx光照，26℃，30转/min低速振荡培养10～15天，得到指数增长期藻液；
[0020]步骤4：取所述指数增长期藻液镜检，待有鞭毛的游动个体后，进行稀释分离，即用毛细管吸取单个藻分别放入装有200μL的F/2培养基的1.5mL离心管中，吸取30次以上，获得稀释分离的至少30个单胞藻种；
[0021]步骤5：6000lx光照，26℃，可静置培养3～5天。镜检有分裂的细胞，并且无原生动物等。
[0022]步骤6：取所述单胞藻培养管全部转入3mL的玻璃试管中，并改用无菌小棉塞塞紧管口，期间每天添加20微升新鲜培养基。6000lx光照，26℃，30转/min低速振荡培养继续培养5～7天。镜检浓度度可达到上百个/毫升，且无原生动物。
[0023]步骤7：得到纯净的虫黄藻藻液，逐级扩增，用于下一步实验或生产。接种比例按藻液：F/2培养基＝1：1～1：2。
[0024]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1中所述缓冲液包括EDTA缓冲液或无菌海水，珊瑚组织与缓冲液的体积比约为1:10。
[0025]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤2中所述原始悬浊液中含有从虫体组织粘液内游离出的单胞藻的细胞为圆形，甲片不明显，无横沟，整体为黄色，偏亮棕油色，大小在10～30μm，看不到鞭毛，无活动能力(如图1所示)。
[0026]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤3和步骤4中所述指数增长期藻液，指数增长期的标志为出现有活动能力的单细胞，约8～20μm，光学显微镜下整体为绿色，略带黄色，单个个体有自由活动阶段，甲片不明显，但横沟较明显(如图2所示)，游动状态可见横沟处的鞭毛(如图3所示)，静止时为球形。
[0027]在本专利技术的一些具体实施方案中步骤5所述的分裂期细胞为二分裂的葫芦形(如图4、图5所示)。
[0028]在本专利技术的一些具体实施方案中步骤6此时的培养液中呈现多种细胞形态(葫芦形，游动细胞形，静止形等)混杂。所述培养的6000lx光照，26℃，30转/min低速振荡培养继
续培养5～7天。镜检浓度度可达到上百个/毫升，且无原生动物。
[0029]在本专利技术的一些具体实施方案中步骤7中扩增所述浓度最终可达到>10万个/mL。
[0030]本专利技术根据珊瑚与虫黄藻共生的特点和相应生理机制，针对性地对珊瑚体内的虫黄藻进行了分离，纯化和体外培养，根据其紧密地共生关系，在培养初期不进行杂质的去除，以保证藻体能逐渐适应体外培养的环境，在进入指数增长期后，再进行分离纯化，得到了纯净的造礁石珊瑚共生虫黄藻藻种。本专利技术为推进虫黄藻生理功能，珊瑚与虫黄藻共生关系的研究，为保护珊瑚礁生态系统，提供切实可行的思路。
[0031]生物保藏说明
[0032]生物材料：中华扁脑珊瑚(Platygyra sinensis)体内的共生藻(虫黄藻)；分类命名：Cladocopium sp.HNPS
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C1
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A；于2021年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.造礁石珊瑚共生虫黄藻藻种，其特征在于，其保藏编号为：CGMCC23075。2.如权利要求1所述的造礁石珊瑚共生虫黄藻藻种在珊瑚与虫黄藻共生关系的研究、珊瑚生理学研究或生态保护中的应用。3.如权利要求1所述的造礁石珊瑚虫黄藻藻种的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得珊瑚组织，与缓冲液混合研磨，获得原始悬浊液；步骤2：取所述原始悬浊液镜检，确定所述原始悬浊液含有游离的单胞藻；步骤3：取所述原始悬浊液接种于F/2培养基中，于6000lx光照，26℃，30转/min低速振荡培养10～15天，得到指数增长期藻液；步骤4：取所述指数增长期藻液镜检，待有鞭毛的游动个体后，进行稀释分离，即用毛细管吸取单个藻放入装有200μL的F/2培养基的1.5mL离心管，重复取30次以上，分别获得稀释分离的至少30管藻种，获得单胞藻；步骤5：6000lx光照，26℃，可静置培养3～5天；镜检有分裂的细胞，并且无原生动物；步骤6：取所述单胞藻培养管全部转入3mL的玻璃试管中，并改用无菌小棉塞塞紧管口，期间每天添加20微升新鲜培养基；6000lx光照，26℃，30转/min低速振荡培养继续培养5～7天；镜检浓度度可达到上百个/毫升，且无原生动物；步骤7：得到纯净的虫黄藻藻液，逐级扩增，用于下一步实验或生产；接种比例按藻液：F/2培养基＝1：1～1：2。4.如权利要求1所述的造礁石珊瑚虫黄藻藻种的体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得珊瑚组织，与缓冲液混合研磨，获得原始悬浊液；步骤2：取所述原始悬浊液镜检，确定所述原始悬浊液含有游离的单胞藻；步骤3：取所述原始悬浊液接种于F/2培养基中，于6000lx光照，26℃，30转/min低速振荡培养10～15天，得到指数增长期藻液；步骤4：取所述指数增长期藻液镜检，待有鞭毛的游动个体后，进行稀释分离，即用毛细管吸取单个藻放入装有200μL的F/2培养基的1.5mL离心管，重复取30次以上，分别获得稀释分离的至少30管藻种，获得单胞藻；步骤5：...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚雪梅，乔立君，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：