事件CTC79005-2，抗虫甘蔗植株，生产和检测抗虫甘蔗植株的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域。更确切地说，一种用于生产转基因植物事件，特别是甘蔗(Saccharum spp.)事件的基因构建体和方法，其抵抗害虫小蔗螟(Diatraea saccharalis)的侵染，后者作为害虫被广泛知晓，描述为普通螟虫、甘蔗螟虫，或仅称为螟虫。本发明专利技术描述了该事件、事件鉴定的方法，以及插入检测方法，以在插入部分和宿主基因组之间交叉的独特区域和特征性的侧翼区域为基础。性的侧翼区域为基础。

【技术实现步骤摘要】
事件CTC79005-2，抗虫甘蔗植株，生产和检测抗虫甘蔗植株的方法


[0001]本专利技术涉及生物
更具体地说，描述了一种用于生产转基因植物事件，特别是甘蔗(Saccharum spp.)事件的基因构建体和方法，该事件表达了赋予对害虫小蔗螟(Diatraea saccharalis，俗称普通螟虫、甘蔗螟虫，或仅称为螟虫)侵染抗性的Cry1Ac毒素。本专利技术描述了一种检测抗甘蔗螟虫侵染的事件和来自该事件的材料，以及识别这种事件的多核苷酸、引物、探针和侧翼区的方法。本专利技术具体地涉及用于检测转基因事件、基因构建体的多核苷酸、引物和方法，从植物样本中检测材料的试剂盒，事件CTC79005-2，抗虫甘蔗植株，以及生产抗虫甘蔗的植株、植物细胞、植物部分或种子的方法。

技术介绍

[0002]甘蔗(Saccharum spp.)是一种属于植物禾本科的草本植物，原产于东南亚，更精确地说，是产于新几内亚和印度尼西亚的广大中部地区。它是热带和亚热带地区生长的最重要的植物品种之一，其面积超过2,300万公顷，分布在121个国家(粮农组织2012年统计年鉴第233页)。
[0003]甘蔗是生产糖、酒、糖蜜、朗姆酒、卡莎萨(巴西的国家蒸馏酒)和燃料乙醇的原材料来源。甘蔗碾磨后产生的甘蔗渣可用于打捆、提供热能、在工厂加工、生产电力(通常卖给用户电网)，或作为生产甘蔗第二代乙醇的原料(BR 11 2014 02385-1)。因此，甘蔗农业产业通过由糖和乙醇的商业化以及植物生物质的可持续优化利用为该地区创造了数百万个工作岗位，并促进了外汇的增长，具有巨大的经济和社会意义。
[0004]最近，随着全球变暖的出现，以及随之而来的对化石燃料(生物燃料)替代品的渴望，全世界对甘蔗的兴趣大大增加。以甘蔗为基础的乙醇作为一种可再生能源，被认为对减少温室气体和对化石燃料的依赖极为重要，从而使其成为控制全球气候变化的一个关键因素(Savage，2011年)。
[0005]由于甘蔗的经济和社会意义，越来越多的研究被用于确定甘蔗种植的最佳农业实践和提高种植品种的质量。改善甘蔗农艺特性的努力集中在提高糖的产量和积累、提高对生物和非生物胁迫的耐受性、对病虫害和病原体的抗性和耐受性，以及开发利用木质纤维素生物质生产甘蔗乙醇的替代技术(PI 0802153-8；PI 0904538-4；PI 1101295-1)。
[0006]现代甘蔗品种的多倍体和非整倍体基因组的复杂性，连同其相对有限的遗传基础和低生育率，给利用常规育种选择具有合乎需求的农艺特性的植株带来了很大的困难和许多限制(Souza等人，2011年；D
′
Hont和Glaszmann，2005年，Basel，第109卷，第1-3期，第27-33页；Cheavegatti-Gianotto等人，2011年)。因此，生产成本高、必须使用手工劳动、产品上市时间线长，可能会阻碍甘蔗产业满足全球市场日益增长的需求。
[0007]在过去的20年里，甘蔗产量的增加不仅是种植园生产力提高的结果，也是种植品种多样性增加的结果，使得种植面积扩大到其他地理区域。这种地理扩张要求开发对不同气候条件的适应品种，使甘蔗市场的可持续性得到不断向市场提供新的和当地适应性种质
的支持，同时得到控制病虫害的能力的支持。
[0008]传统的育种方法对于不断提供新品种是很重要的，但不足以满足现代市场的需求，因为部分特征不是建立在品种的遗传背景上的，最根本的是开发有效的方法以引入外源基因。由于传统育种方法的局限性，以及对快速有效纳入合乎需求的性状的日渐增长的需求，基因工程(生物技术)在甘蔗育种计划中的应用已经变得越来越突出，特别是由于通过基因工程整合合乎需求的农艺性状在其他植物品种(例如大豆、玉米、油菜籽、甜菜和棉花)获得了商业成功。
[0009]植物基因工程涉及将目的基因转移到植物细胞中(基因转化)，以这样的方式：使可育性和农艺上优越的后代保持并稳定地表达负责所需性状的基因。
[0010]尽管甘蔗具有通过基因工程进行遗传改变(整合入合乎需求特性)的潜力[病毒抗性(Guo等，2015；Zhu等，2011)、昆虫(Kalunke，Kolge，Babu，&Prasad，2009；Weng等,2011)、除草剂(Enr
í
quez-Obregon，Vazquez-Padron，Prieto-Samsonov，De la Riva，&Selman-Housein，1998；van der Vyver，Conradie，Kossmann，&Lloyd，2013)、耐旱性(Molinari等人,2007；Reis等，2014)、盐度(Kumar，Uzma，Khan，Abbas，&Ali，2014)和铝毒性(Ribeiro，2016)、糖分的产量和积累提升(Bewg，Poovaiah，Lan，Ralph，&Coleman，2016；Mudge等，2013)]，这种方法受到甘蔗内在特性的限制。与玉米、水稻、小麦和其他商业谷物不同，甘蔗在组织培养繁殖方面表现出困难，胚性愈伤组织的诱导和再生率低，并且不可能将合子胚作为基因转化的靶组织[(Anderson&Birch，2012；Basnayake，Moyle，&Birch，2011；Molinari等，2007)]。经常观察到甘蔗基因型之间转化效率低和变异性高，为了成功地利用基因工程将合乎需求的农艺性状引入甘蔗中，仍有许多挑战需要克服。
[0011]甘蔗被认为是对遗传转化顽抗的物种，尽管已经对该物种的几种遗传工程方法进行了评估，但仍然没有标准的方案以确保转基因事件的产生(Smith等人，1992；Rathius&Birch.1992；Rathius&Birch 1992.；Chen等人，1987；Arencibia 1998；Manickavasagam等人。2004；Elliott等人，1998).
[0012]除了该物种的固有限制阻止了现有基因工程技术的应用外，甘蔗基因组的复杂性(高倍性水平和非整倍性)阻止了通过回交(特定基因型的重组)将性状的基因掺入到特定栽培品种中，如同通常在其他商业利益作物中进行的那样。因此，为了在一个以上的种质中"插入"相同的性状而使不同地理区域的生产力得到提高，有必要实行新的遗传转化，承担与为该性状而获得的第一次事件相关的相同的成本和风险。即使在今天，在不同品种的甘蔗中插入相同的特性，成功的可预测性也很低，是一个极度依赖基因型的过程，这使得该物种的转基因产品组合的构建具有挑战性。
[0013]该物种的基因型复杂性也极大地影响了对所产生事件的表征(为确保其商业化所必需的特征的存在)。转基因事件的明确识别是确保其可追溯性和监测的根本，这是其商业化的监管要求。甘蔗基因组的高度多倍性和大量的重复区域，连同关于其组织和结构的信息的缺乏，使得对所产生的转基因事件的表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的至少14个连续的核苷酸。2.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的至少15个连续的核苷酸。3.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的至少16个连续的核苷酸。4.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18。5.根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:13。6.一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的至少14个连续的核苷酸。7.权利要求6的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的至少15个连续的核苷酸。8.权利要求6的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的至少16个连续的核苷酸。9.权利要求6的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19。10.根据权利要求6-9中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:12。11.根据权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:5。12.根据权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:22。13.包含正向引物和反向引物的引物对，其中正向引物包括SEQ ID NO:6且反向引物包括SEQ ID NO:7，或正向引物包括SEQ ID NO:8且反向引物包括SEQ ID NO:9。14.一种检测来自事件CTC79005-2的转基因甘蔗的植物材料的方法，包括以下步骤：a)获得用于分析的植物材料样品；b)从样品中提取DNA；c)提供包含至少一个正向和一个反向引物的引物对；d)扩增引物对之间的区域；并且e)检测扩增产物的存在。15.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的连续的核苷酸。16.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物由包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的连续的核苷酸的第一引物和包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸的第二引物组成。17.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其至少一对引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的连续的核苷酸。18.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一个引物对由包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的连续的核苷酸的第一引物和包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸的第二引物组成。19.权利要求14的方法，其中正向引物包含SEQ ID NO:6且反向引物包含SEQ ID NO:7，或正向引物包含SEQ ID NO:8且反向引物包含SEQ ID NO:9。20.权利要求14的方法，其中扩增产物包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。21.权利要求14的方法，其中扩增产物的检测是通过包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针杂交进行的。
22.一种检测来自事件CTC79005-2的转基因甘蔗的材料的方法，包括以下步骤：a)获得用于分析的植物材料样品；b)从样品中提取DNA或RNA；c)提供一种探针或提供探针的组合，其设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自由SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38和SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：巴西甘蔗技术中心，
类型：发明
国别省市：