一种松材线虫入侵林分褐梗天牛快速分子检测方法技术

本发明专利技术涉及分子检测技术领域，具体涉及一种松材线虫入侵林分褐梗天牛快速分子检测方法。本发明专利技术提供褐梗天牛特异性引物对，可在短时间内快速、准确地检测褐梗天牛；本发明专利技术提供的快速分子检测方法不受虫态和地理种群的限制，对除成虫以外的其它虫态(卵、幼虫和蛹)也可进行鉴定。采用本发明专利技术提供的特异性引物，可用于松材线虫侵染林中褐梗天牛的快速鉴定，及时清理带虫木，防止媒介昆虫被人为传播到其他地区，以期能有效控制松材线虫的进一步传播和扩散。扩散。

【技术实现步骤摘要】
一种松材线虫入侵林分褐梗天牛快速分子检测方法


[0001]本专利技术涉及分子检测
，具体涉及一种松材线虫入侵林分褐梗天牛快速分子检测方法。

技术介绍

[0002]松材线虫病又称松树枯萎病(pine wilt disease，PWN)，是由松材线虫寄生松树引起的具有毁灭性的检疫性森林病害，被称作松树的“癌症”。松材线虫本身不具备自主传播能力，主要依靠媒介昆虫携带进行短距离传播，而其长距离传播主要是借助媒介昆虫和疫木携带通过物质运输、人类活动传播。因此，控制媒介昆虫，是松材线虫病防控的重要途径。
[0003]褐梗天牛Arhopalus rusticus(Linnaeus)又称褐幽天牛，属鞘翅目(Celeoptera)，天牛科(Cerambycidae)，幽天牛亚科(Aseminae)，梗天牛属(Arhopalus)。Linit等研究发现褐梗天牛可以携带扩散型松材线虫(Linit,1988)。此后，大量研究发现褐梗天牛可以携带松材线虫，并认为褐梗天牛可能会传播松材线虫(Mamiya and Tamura,1977；Ridley et al.,2001；Maja et al.,2012)。高娜等(2013)通过对褐梗天牛及松墨天牛的生态位进行分析，认为褐梗天牛极有可能携带并传播松材线虫。王洋(2020)通过室内实验研究发现，褐梗天牛成虫羽化后可取食黑松针叶，仅吸取汁液不取食植物组织，可在针叶表面造成取食伤口并可从取食枝条中分离到松材线虫。另外，侯瑞(2019)研究发现褐梗天牛携带形态与松材线虫扩散型4龄幼虫一致的线虫，此现象与松墨天牛携带松材线虫、传播松材线虫病的规律一致。因此，褐梗天牛同样是松材线虫的潜在媒介昆虫。
[0004]目前，褐梗天牛的鉴定方法主要依据成虫形态特征的传统形态学鉴定方法和基于DNA条形码技术检测方法，而实际检疫过程中常常遇到标本受损或非成虫等情况。在传统形态学鉴定工作中，需要专业的昆虫分类知识；同时，其卵、幼虫、蛹三个虫态下，褐梗天牛与其它天牛科的形态特征也极其相似。因此，在松材线虫入侵林分内，不同虫态的限制实现褐梗天牛的准确鉴定，已成为亟待解决的问题。
[0005]近些年，分子生物学的快速发展已为昆虫快速准确地鉴定提供了强有力的技术支撑。DNA条形码技术鉴定方法利用线粒体的细胞色素氧化酶I基因(COI)对通过样品获取、DNA提取、PCR扩增、公司序列测定等过程获得的序列经过美国国家生物信息技术中心(NCBI)提供的在线序列对比程序(BLAST)快速而准确地鉴定物种。然而，此方法需要经过第三方公司参与测序，耗费时间较长。

技术实现思路

[0006]对于天牛的形态鉴定，需要鉴定者具备扎实的专业基础以及丰富的经验，且只有在获得成虫时才可完成鉴定工作，处于卵、幼虫、蛹这三个虫态的天牛科昆虫形态上极其相似。同时，实际检疫过程中常常会遇到标本受损等情况，使得形态鉴定难以进行；DNA条形码检测技术虽然可将样品进行测序后通过序列比对鉴定种类，但需要第三方公司测序，耗费
时间较长。
[0007]本专利技术的目的是提供一种对褐梗天牛进行快速检测的方法，具体地，本专利技术建立了基于SS
‑
CO I的褐梗天牛的分子快速鉴定技术体系，首先提取天牛样本的基因组DNA，后运用普通PCR的方法，经琼脂糖凝胶电泳显像，即可实现对褐梗天牛的快速准确地鉴定。整个鉴定周期仅需2
‑
3h，有助于提高检疫部门的工作效率。
[0008]本专利技术以褐梗天牛为靶标，以北方地区松材线虫侵染林分中的其它6种常见天牛科昆虫作为参照，设计基于线粒体CO I基因序列的特异性引物，构建了基于SS
‑
CO I的褐梗天牛快速分子检测体系。
[0009]第一方面，本专利技术提供引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1
‑
2所示。
[0010]根据本领域技术人员的理解，本专利技术还请求保护，上述引物对在制备检测褐梗天牛的试剂或试剂盒中的应用。
[0011]第二方面，本专利技术提供含有上述引物对的试剂或试剂盒。
[0012]本专利技术还请求保护，上述的引物对或上述的试剂或试剂盒在褐梗天牛检测中的应用。
[0013]上述的引物对或上述的试剂或试剂盒在松材线虫检测中的应用。
[0014]上述的引物对或上述的试剂或试剂盒在林场松材线虫或褐梗天牛防治中的应用。
[0015]上述的引物对或上述的试剂或试剂盒在木质包装材料、疫木、电缆盘、光缆盘中褐梗天牛的快速准确鉴定中的应用。
[0016]在上述的应用中，采用上述的引物对或上述的试剂或试剂盒对待测物品进行PCR扩增，若能扩增出条带，所述待测物品中含有褐梗天牛。
[0017]第三方面，本专利技术还提供一种检测褐梗天牛的方法，采用上述的引物对或上述的试剂或试剂盒对待测样品进行PCR扩增，若能扩增出条带，所述待测样品中含有褐梗天牛。
[0018]第四方面，本专利技术提供一种预防松材线虫病的方法，使用上述的引物对或上述的试剂或试剂盒对待测样品进行PCR扩增，若能扩增出条带，所述待测样品中含有褐梗天牛，将携带褐梗天牛的带虫木进行清理。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020]本专利技术利用分子生物学手段，在短时间内快速、准确地对林木钻蛀性检疫害虫——褐梗天牛进行检测；本专利技术提供的检测引物，可在不受虫态和地理种群的限制下完成鉴定工作，尤其针对除成虫以外其它虫态(卵、幼虫和蛹)的鉴定工作。
[0021]本专利技术可用于松材线虫侵染林分中褐梗天牛的快速鉴定，及时清理带虫木；同时，本专利技术也可快速鉴别木质包装材料、疫木、电缆盘、光缆盘中的褐梗天牛，防止媒介昆虫被人为传播到其他地区，以期能有效控制松材线虫的进一步传播和扩散。
附图说明
[0022]图1是本专利技术实施例2中CO I通用引物的扩增结果，其中，泳道M为Maker，(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道N为蒸馏水对照，泳道1
‑
7分别为褐梗天牛Arhopalus rusticus、脊鞘幽天牛Asemum striatum、小灰长角天牛Acanthocinus griseus、灰长角天牛Acanthocinus aedilis、松皮花天牛Rhagium inquisitor japonicum、四点象天牛Mesosa myops、云杉花墨天牛Monochamus saltuarius。
[0023]图2是本专利技术实施例4中SS
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CO I引物AzF/AzR的特异性结果，其中，泳道M为Maker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)，泳道N为蒸馏水对照，泳道1
‑
7分别为褐梗天牛Arhopalus rusticus、脊鞘幽天牛Asemum striatum、小灰长角天牛Acanthocinus griseus、灰长角天牛Acanthocinus aedilis、松皮花天牛Rhagi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1
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2所示。2.权利要求1所述的引物对在制备检测褐梗天牛的试剂或试剂盒中的应用。3.含有权利要求1所述引物对的试剂或试剂盒。4.权利要求1所述的引物对或权利要求3所述的试剂或试剂盒在褐梗天牛检测中的应用。5.权利要求1所述的引物对或权利要求3所述的试剂或试剂盒在松材线虫检测中的应用。6.权利要求1所述的引物对或权利要求3所述的试剂或试剂盒在林场松材线虫或褐梗天牛防治中的应用。7.权利要求1所述的引物对或权利要求3所述的试剂或试剂盒在木质包装材料、疫木、电缆盘、光缆盘中褐梗天牛的快速准确鉴定中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶静，骆有庆，任利利，庄佳敏，张赛男，武海卫，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：