基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒。本发明专利技术提供了具有如SEQ ID NO.1～6所示核苷酸序列的引物、具有如SEQ ID NO.7和8所示核苷酸序列的探针。本发明专利技术灵敏性好，远低于荧光定量PCR的检测限，避免可能出现的假阴性；可同时进行两个检测通道和一个内控通道的检测，减少了多次加样可能造成的污染；多重数字PCR实现芯片内液滴数的绝对定量，无需依赖标准曲线，定量结果更加准确。加准确。

【技术实现步骤摘要】
基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒。

技术介绍

[0002]恙虫病是由东方恙虫感染导致的自然疫源性疾病，中间宿主是恙螨，主要通过叮咬传播至人体。恙虫病的主要症状包括发烧、皮疹、肌痛、淋巴结肿大、恶心、呕吐、焦痂(在螨咬伤部位出现黑点)、腹痛和非特异性流感等，同时可能会有多种并发症：黄疸、急性肾功能衰竭和弥散性血管内凝血(DIC)、急性呼吸窘迫综合征、心肌炎和脑膜脑炎，甚至多器官衰竭。令人头疼的是，恙虫病的症状与钩端螺旋体病、登革热、布鲁氏菌病和伤寒等疾病类似，这使得鉴别诊断十分困难。恙螨叮咬部位出现焦痂是临床诊断恙虫病的特异性标志物(98.9％)，然而，焦痂的存在在患者中的差异很大，从7％～97％不等，尤其是印度和其他亚洲人群中焦痂的存在量很少，不适合用于诊断东方恙虫，因此，诊断更依赖于实验室检测。恙虫病的实验室诊断依赖于血清学检测，如Weil
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Felix检测、间接免疫荧光检测、间接免疫过氧化物酶检测、酶联免疫吸附检测(ELISA)和免疫层析检测(ICT)等，其中ELISA检测IgM对诊断恙虫病最为可靠。然而，血清学检测仍存在灵敏度特异性不足、操作繁琐、技术要求高，成本需求大等弊端，尤其是灵敏度不够，限制了其诊断价值。
[0003]另一方面，基于分子的方法，如聚合酶链反应(PCR)，对恙虫病的诊断具有应用价值。目前，PCR具有检测周期短、高灵敏高特异等优点，同时，定量PCR可用于监测治疗效果和预后评估，极具临床意义。主流的分子检测以荧光定量PCR为主，但随着技术的发展，新一代分子检测技术——数字PCR逐渐崭露头角。数字PCR(DigitalPCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术，其核心是通过大规模单分子扩增实现拷贝数的直接绝对定量，直接获知目标核酸分子的个数，提高了检测灵敏度和准确度。数字PCR具有超高灵敏度、高特异性、绝对定量、高耐受性等优势，能够早期、快速、准确、定量的诊断东方恙虫。
[0004]而荧光定量PCR的灵敏度低于数字PCR，可造成漏检，出现假阴性；再者，荧光定量PCR通常只能做到两个荧光通道同时检测，无法兼顾内控通道。或者检测两份，即分别采用两个基因和一个内控基因构成检测体系；最后，荧光定量PCR实现拷贝数的定量依赖于标准曲线，经已知浓度标准品推算未知浓度的样本，没有实现真正的绝对定量。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒，该引物或试剂盒具有灵敏度高、多靶标性、绝对定量的优点。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了引物，其具有：
[0008](I)、如SEQ ID NO.1～6中任意所示的核苷酸序列；或
[0009](II)、如(I)所示的核苷酸序列的互补序列；或
[0010](III)、如(I)或(II)所示的苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的
核苷酸序列，且功能与(I)或(II)的相同或相似，所述多个为2个至10个；或
[0011](IV)、与(I)～(III)任意所示的核苷酸序列同源性达到不低于80％的核苷酸序列。
[0012]本专利技术提供了探针，其具有：
[0013](V)、如SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；或
[0014](VI)、如(V)所示的核苷酸序列的互补序列；或
[0015](VII)、如(V)或(VI)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(V)或(VI)的相同或相似，所述多个为2个至10个；或
[0016](VIII)、与(V)～(VII)任意所示的核苷酸序列同源性达到不低于80％的核苷酸序列。
[0017]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述探针具有VIC荧光基团和/或MGB。
[0018]在本专利技术的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的修饰为成倍扩增。
[0019]在本专利技术的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的取代为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个和/或10个碱基。
[0020]在本专利技术的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的缺失为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个和/或10个碱基。
[0021]在本专利技术的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的添加为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个和/或10个碱基。
[0022]在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术提供的引物组的核苷酸序列与上述引物组的核苷酸序列的同源性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0023]本专利技术还提供了引物探针组，其包括上述引物和/或上述探针。
[0024]本专利技术还提供了上述引物、上述探针和/或上述引物探针组在制备东方恙虫的定性和/或定量试剂盒中的应用。
[0025]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述应用中所述试剂盒适用于进行数字PCR。
[0026]本专利技术还提供了试剂盒，其包括上述引物、上述探针和/或上述引物探针组，以及可接受的辅料和/或助剂。
[0027]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述述试剂盒适用于进行数字PCR。
[0028]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述试剂盒的反应体系包括：
[0029]3μL5Xmix；
[0030]0.15μL初始浓度为100μM的上游引物；
[0031]0.15μL初始浓度为100μM的下游引物；
[0032]0.0375μL初始浓度为100μM的探针；
[0033]模板和ddH2O；共15μL。
[0034]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述试剂盒的扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15s，56～62℃退火延伸30s，返回变性然后退火延伸，如此循环39次。
[0035]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述的辅料或助剂包括DMSO、TMAC、SSB、甲酰胺、海藻糖、甜菜碱、非离子型洗涤剂、dNTPs、UDG酶、Tth酶和/或MgCl2中的一种或多种。
[0036]本专利技术还提供了东方恙虫的检测方法，其包括使用上述引物、上述探针和/或上述
引物探针组对待测样品扩增、检测；或使用上述试剂盒对待测样品进行扩增检测。
[0037]本专利技术还提供了检测装置，其包被有上述引物、上述探针和/或上述引物探针组。
[0038]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述检测装置包括芯片或其他可接受的载体。
[0039]本专利技术的引物以及试剂盒有如下效果：
[0040](1)多重数字PCR的检测限远低于荧光定量PCR的检测限，避免可能出现的假阴性；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.引物，其特征在于，具有：(I)、如SEQ ID NO.1～6中任意所示的核苷酸序列；或(II)、如(I)所示的核苷酸序列的互补序列；或(III)、如(I)或(II)所示的苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(I)或(II)的相同或相似，所述多个为2个至10个；或(IV)、与(I)～(III)任意所示的核苷酸序列同源性达到不低于80％的核苷酸序列。2.探针，其特征在于，具有：(V)、如SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；或(VI)、如(V)所示的核苷酸序列的互补序列；或(VII)、如(V)或(VI)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(V)或(VI)的相同或相似，所述多个为2个至10个；或(VIII)、与(V)～(VII)任意所示的核苷酸序列同源性达到不低于80％的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的探针，其特征在于，具有VIC荧光基团和/或MGB。4.引物探针组，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物和/或如权利要求2或3所述的探针。5.如权利要求1所述的引物、如权利要求2或...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾兵，胡雪姣，赵云虎，刘素玲，周晖，张莉滟，凌勇，张鑫强，袁凯旋，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：