底数大于2的指数核酸扩增制造技术

本文描述了提供高效核酸扩增的方法和组合物。在一些实施方案中，这允许每个扩增循环的扩增产物的大于2倍的增加，并因此相对于常规PCR提高了灵敏度和速度。规PCR提高了灵敏度和速度。规PCR提高了灵敏度和速度。

【技术实现步骤摘要】
底数大于2的指数核酸扩增
[0001]本申请是申请日为2015年12月15日，申请号为201580076131.0(国际申请号PCT/US2015/065890)，专利技术名称为“底数大于2的指数核酸扩增”的专利技术专利申请的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求于2014年12月15日提交的美国临时申请No.62/092,102的权益，所述临时申请以引用的方式全文纳入本文。
[0004]在联邦资助的研究和开发下做出的关于专利技术权利的声明
[0005]不适用。


[0006]本文所述的方法和组合物通常涉及核酸扩增领域。特别地，本文所述为用于增大扩增效率的方法和组合物。

技术介绍

[0007]多种核酸扩增方法是可获得的，并且许多方法已用于实现基于核酸检测的灵敏诊断测定。聚合酶链式反应(PCR)仍然是最广泛使用的DNA扩增和定量方法。巢式PCR、两步PCR用于增大PCR的特异性和灵敏度(美国专利No.4,683,195)。用于PCR扩增的巢式引物为具有与靶序列上反向引物和正向引物靶向位点之间的区域互补的序列的寡核苷酸。然而，PCR通常具有若干限制。PCR扩增在每个循环仅能够实现靶序列量的少于两倍的增加。这仍然是相对较低的。此外，该方法的灵敏度通常受限，使其难以在单个反应中检测仅以少数分子存在的靶标。

技术实现思路

[0008]本文描述了基于使用新引物(例如，新的内引物)的方法和组合物，所述新引物被设计以使在扩增后产生的扩增子中维持外引物结合位点。
[0009]本文提供了以下实施方案：实施方案1：用于扩增样品中靶核酸的核酸引物组，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述引物组包括至少两种第一引物形式的或能够形成至少两种第一引物的寡核苷酸，所述第一引物能够与所述第一模板链杂交，其中所述至少两种第一引物包括第一外引物和第一内引物，所述第一外引物包含与第一模板链序列a
’
特异性杂交的引物序列a；并且所述第一内引物包含与第一模板链序列b
’
特异性杂交的单链引物序列b，其中b
’
邻近于并且是a
’
的5
’
，并且其中单链引物序列b在其5
’
端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含引物序列a，其邻近于并且是单链引物序列b的5
’
；和夹(clamp)序列c，其邻近于并且是引物序列a的5
’
，其中夹序列c不与第一链模板序列d
’
互补，所述序列d
’
邻近于并且是第一链模板序列a
’
的3
’
。
[0010]实施方案2：实施方案1的引物组，其中所述引物组任选地包括至少一种第二引物，其能够与所述第二模板链特异性杂交。
[0011]实施方案3：扩增样品中靶核酸的方法，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述方法包括：
[0012](a)使所述样品与以下接触：
[0013](i)至少两种能够与所述第一模板链杂交的第一引物，其中所述至少两种第一引物包括第一外引物和第一内引物，所述第一外引物包含与第一模板链序列a
’
特异性杂交的引物序列a；并且所述第一内引物包含与第一模板链序列b
’
特异性杂交的单链引物序列b，其中b
’
邻近于并且是a
’
的5
’
，并且其中单链引物序列b在其5
’
端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含引物序列a，其邻近于并且是单链引物序列b的5
’
；和夹序列c，其邻近于并且是引物序列a的5
’
，其中夹序列c不与第一链模板序列d
’
互补，所述序列d
’
邻近于并且是第一链模板序列a
’
的3
’
；和
[0014](ii)至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物，
[0015]其中，如果存在，所述接触在其中引物退火至它们的模板链的条件下进行；以及
[0016](b)在发生链置换的条件下，如果存在，使用缺少5
’‑3’
外切核酸酶活性的DNA聚合酶扩增靶核酸以产生扩增子，所述扩增子包含从模板序列a
’
延伸至所述第二引物结合位点的序列。
[0017]实施方案4：任一前述实施方案的引物组或方法，其中所述DNA聚合酶包含链置换活性。
[0018]实施方案5：任一前述实施方案的引物组或方法，其中双链形式的结合序列c
‑
a的T
m
大于双链形式的结合序列a
‑
b的T
m
。
[0019]实施方案6：任一前述实施方案的引物组或方法，其中结合序列c
‑
a比结合序列a
‑
b更富含GC和/或包含更多稳定的碱基。
[0020]实施方案7：实施方案3
‑
6的方法，其中所述扩增在PCR的指数期中以最高达3
循环数
的速率扩增靶核酸。
[0021]实施方案8：实施方案3
‑
7的方法，其中所述扩增允许在比仅使用单一正向引物和单一反向引物的所述检测所需的扩增循环少约12％
‑
42％的扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸。
[0022]实施方案9：实施方案1、2、5或6的引物组或实施方案3
‑
8的方法，其中所述第二引物包括至少两种第二引物形式的或能够形成至少两种第二引物的寡核苷酸，所述第二引物能够与所述第二模板链杂交，其中所述至少两种第二引物包括第二外引物和第二内引物，所述第二外引物包含与第二模板链序列e
’
特异性杂交的引物序列e；并且所述第二内引物包含与第二模板链序列f
’
特异性杂交的单链引物序列f，其中f
’
邻近于并且是e
’
的5
’
，并且其中单链引物序列f在其5
’
端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含引物序列e，其邻近于并且是单链引物序列f的5
’
；和夹序列g，其邻近于并且是引物序列e的5
’
，其中夹序列g不与第二链模板序列h
’
互补，所述序列h
’
邻近于并且是第二链模板序列e
’
的3
’
。
[0023]实施方案10：实施方案9的引物组或方法，其中双链形式的结合序列g
‑
e的T
m
大于双链形式的结合序列e
‑
f的T
m
。
[0024]实施方案11：实施方案9或1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一个用于扩增样品中靶核酸的核酸引物组，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述引物组包括至少两种第一引物形式的或能够形成至少两种第一引物的寡核苷酸，所述第一引物能够与所述第一模板链杂交，其中所述至少两种第一引物包括第一外引物和第一内引物，所述第一外引物包含与第一模板链序列a
’
特异性杂交的引物序列a；并且所述第一内引物包含与第一模板链序列b
’
特异性杂交的单链引物序列b，其中b
’
邻近于并且是a
’
的5
’
，并且其中单链引物序列b在其5
’
端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含引物序列a，其邻近于并且是单链引物序列b的5
’
；和夹序列c，其邻近于并且是引物序列a的5
’
，其中夹序列c不与第一链模板序列d
’
互补，所述序列d
’
邻近于并且是第一链模板序列a
’
的3
’
。2.权利要求1的引物组，其中所述引物组额外地包括至少一种第二引物，所述第二引物能够与所述第二模板链特异性杂交。3.一种扩增样品中靶核酸的方法，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述方法包括：(a)使所述样品与以下接触：(i)至少两种能够与所述第一模板链杂交的第一引物，其中所述至少两种第一引物包括第一外引物和第一内引物，所述第一外引物包含与第一模板链序列a
’
特异性杂交的引物序列a；并且所述第一内引物包含与第一模板链序列b
’
特异性杂交的单链引物序列b，其中b
’
邻近于并且是a
’
的5
’
，并且其中单链引物序列b在其5
’
端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含引物序列a，其邻近于并且是单链引物序列b的5
’
；和夹序列c，其邻近于并且是引物序列a的5
’
，其中夹序列c不与第一链模板序列d
’
互补，所述序列d
’
邻近于并且是第一链模板序列a
’
的3
’
；和(ii)至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物，其中，如果存在，所述接触在其中引物退火至它们的模板链的条件下进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：塞弗德公司，
类型：发明
国别省市：