衔接子分子、该衔接子分子与生物分子结合而成的生物分子-衔接子分子复合体、生物分子分析装置和生物分子分析方法制造方法及图纸

更简便且切实地使生物分子在纳米孔内往复运动。一种衔接子分子，其与分析对象的生物分子直接或间接地结合，且具有由单链核苷酸构成的立体结构形成区域。成的立体结构形成区域。成的立体结构形成区域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】衔接子分子、该衔接子分子与生物分子结合而成的生物分子
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衔接子分子复合体、生物分子分析装置和生物分子分析方法


[0001]本专利技术涉及在核酸等生物分子的分析中使用的衔接子分子、结合有该衔接子分子的生物分子
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衔接子分子复合体、生物分子分析装置和生物分子分析方法。

技术介绍

[0002]蛋白质、核酸分子等生物分子分别具有氨基酸、核苷酸这样的单体连接而成的结构。对于这些生物分子的蛋白质，使用自动进行埃德曼法的装置(被称为肽测序仪或蛋白质测序仪)来确定单体序列。作为确定核酸分子的单体序列(碱基序列)的装置，已知采用桑格法、Maxam
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Gilbert法的第一代测序仪；使用将焦磷酸测序法、桥式PCR法与边合成边测序(sequence
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by
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synthesis，SBS)技术组合的方法的第2代测序仪。
[0003]另一方面，在下一代DNA测序仪的领域中，不进行延伸反应、荧光标记，以电的方式对DNA的碱基序列直接进行测定的方法受到关注。具体而言，关于不使用试剂而直接测定DNA链来确定碱基序列的所谓纳米孔DNA测序方式的研究开发正在活跃地进行近。
[0004]该纳米孔DNA测序方式中，对由于DNA链穿过在薄膜中形成的细孔(以下称为“纳米孔”。)而产生的封闭电流进行测定，从而测定碱基序列。即，由于封闭电流随着DNA链所含的各个碱基种类的不同而变化，因此可以通过测定封闭电流量来依次鉴定碱基种类。在该方式中，与上述各种测序仪不同，不需要进行基于以DNA链为模板的酶的扩增反应、附加荧光体等标记物。因此，纳米孔DNA测序方式与以往的各种测序仪相比，为高通量、低运行成本，并且能够进行长碱基的DNA解读。
[0005]该纳米孔DNA测序方式通常通过生物分子分析用设备来实现，该生物分子分析用设备具备：充满电解质溶液的第1液槽和第2液槽、分隔该第1液槽和第2液槽且具有纳米孔的薄膜、以及设于第1液槽和第2液槽的第1电极和第2电极。生物分子分析用设备也可以构成为阵列设备。阵列设备是指具备多个由薄膜分隔的液室组的设备。例如可以将第1液槽设为公共槽，将第2液槽设为多个独立槽。这种情况下，在公共槽和独立槽中分别配置电极。
[0006]在该构成中，在第1液槽与第2液槽之间施加电压，且使与纳米孔径相对应的离子电流流过纳米孔。另外，在纳米孔中形成与施加的电压相对应的电位梯度。如果将生物分子导入第1液槽中，则基于扩散效应和其产生的电位梯度，生物分子经由纳米孔而被送往第2液槽。关于离子电流的大小，作为一次近似，与纳米孔的截面积成比例。如果DNA穿过纳米孔，则DNA将纳米孔封闭，有效截面积减小，因此离子电流减小。该电流称为封闭电流。基于封闭电流的大小来判断DNA的单链和双链的差异、碱基的种类。
[0007]另外，此外还已知如下方式：将探针电极对相对地设置在纳米孔的内侧面等，并对电极间施加电压，从而测定穿过纳米孔时的DNA与探针电极间的隧道电流，根据隧道电流的大小来判断碱基的种类。
[0008]作为纳米孔DNA测序方式的课题之一，可列举穿过纳米孔的DNA的运送控制。为了通过封闭电流量测定DNA链所含的各个碱基种类的不同，认为需要根据测定时的电流噪音
和DNA分子的波动的时间常数，将DNA的纳米孔穿过速度设为每个碱基100μs以上。但是，DNA的纳米孔通过速度通常较快，为每个碱基1μs以下，难以充分测定来自各碱基的封闭电流。
[0009]作为运送控制法之一，有利用在DNA聚合酶进行互补链合成反应时、解旋酶解开双链DNA时对作为模板的单链DNA进行运送、控制的力的方法(例如参照非专利文献1)。DNA聚合酶结合于作为模板的DNA，从互补结合于模板DNA的引物的端部开始进行互补链合成反应。第1液槽中，通过DNA聚合酶在纳米孔附近进行互补链合成反应，从而将模板DNA经由纳米孔运送至第2液槽。将该DNA聚合酶、解旋酶称为分子马达。
[0010]另外，如专利文献1记载的那样，通过使分析对象的单链DNA经由纳米孔在第1液槽与第2液槽之间往复运动，从而能够提高测定精度。即，使分析对象的单链DNA在第1液槽与第2液槽之间往复运动并进行多次测定，从而能够补正单次测定中产生的误差。此时，如专利文献1所记载的那样，通过在分析对象的单链DNA中的一个端部结合第一阻断分子(大于纳米孔径)，从而使得单链DNA从该单链DNA的另一个端部经由纳米孔而移动至第2液槽，在第2液槽内使第二阻断分子(大于纳米孔径)结合于单链DNA的另一个端部。由此，能够使单链DNA的一个端部留在第1液槽内，另一个端部留在第2液槽内，能够在往复运动时防止单链DNA从纳米孔掉落。
[0011]现有技术文献
[0012]非专利文献
[0013]非专利文献1：Gerald M Cherf等、Nat.Biotechnol.30，No.4，p.349
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353、2012
[0014]专利文献
[0015]专利文献1：日本专利第5372570号

技术实现思路

[0016]专利技术要解决的课题
[0017]如上所述，通过使生物分子在第1液槽和第2液槽间经由纳米孔而往复运动，从而实现了读取精度的提高。然而，经由纳米孔的往复运动、即生物分子的运送控制在技术上非常困难，需要更简便且切实地使生物分子往复运动的技术。
[0018]在此，鉴于上述情况，本专利技术的目的在于提供一种能够使分析对象的生物分子更简便且切实地经由纳米孔进行往复运动的衔接子分子、该衔接子分子与生物分子结合而成的生物分子
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衔接子分子复合体、生物分子分析装置和生物分子分析方法。
[0019]用于解决课题的手段
[0020]达成上述目的的本专利技术包含以下内容。
[0021](1)一种衔接子分子，其能与分析对象的生物分子直接或间接地结合，且具有由单链核苷酸构成的立体结构形成区域。
[0022](2)如(1)记载的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与上述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于上述一个端部的另一个端部连接、且具有上述立体结构形成区域。
[0023](3)如(1)记载的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与上述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及一
对单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于上述一个端部的另一个端部连接、且由彼此不互补的碱基序列构成，上述立体结构形成区域位于这一对单链核酸区域中具有5
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末端的单链核酸区域内。
[0024](4)如(1)记载的衔接子分子，其特征在于，具备相对于上述立体结构形成区域的至少一部分具有互补的碱基序列的立体结构形成抑制寡聚体。
[0025](5)如(4)记载的衔接子分子，其特征在于，上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种衔接子分子，其能够与分析对象的生物分子直接或间接地结合，且具有由单链核苷酸构成的立体结构形成区域。2.根据权利要求1所述的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与所述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于所述一个端部的另一个端部连接、且具有所述立体结构形成区域。3.根据权利要求1所述的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与所述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及一对单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于所述一个端部的另一个端部连接、且由彼此不互补的碱基序列构成，所述立体结构形成区域位于这一对单链核酸区域中具有5
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末端的单链核酸区域内。4.根据权利要求1所述的衔接子分子，其特征在于，具备相对于所述立体结构形成区域的至少一部分具有互补的碱基序列的立体结构形成抑制寡聚体。5.根据权利要求4所述的衔接子分子，其特征在于，所述立体结构形成抑制寡聚体与所述立体结构形成区域的至少一部分进行了杂交，相比于立体结构形成抑制寡聚体进行了杂交的部分更靠近末端的一侧为单链。6.根据权利要求3所述的衔接子分子，其特征在于，所述一对单链核酸区域中端部为3
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末端的单链核酸区域具备与所述生物分子的分析装置中的纳米孔的直径相比直径更大的防脱落部。7.根据权利要求6所述的衔接子分子，其特征在于，所述防脱落部为能与所述单链核酸区域结合的分子或在所述单链核酸区域内的互补区域形成的发夹结构。8.根据权利要求3所述的衔接子分子，其特征在于，所述一对单链核酸区域中端部为3
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末端的单链核酸区域具备可结合分子马达的分子马达结合部。9.根据权利要求8所述的衔接子分子，其特征在于，具备所述分子马达结合部的单链核酸区域具备使引物可在比该分子马达结合部更靠近3
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末端的一侧进行杂交的引物结合部。10.根据权利要求9所述的衔接子分子，其特征在于，在所述分子马达结合部与所述引物结合部之间，具有无法结合所述分子马达的间隔区。11.一种衔接子分子，其为能与分析对象的生物分子直接或间接地结合、且由单链核苷酸构成的衔接子分子，具有多个如下的组，所述组为可结合分子马达的分子马达结合部与使引物可在比该分子马达结合部更靠近3
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末端的一侧进行杂交的引物结合部的组。12.根据权利要求11所述的衔接子分子，其特征在于，在所述分子马达结合部与所述引物结合部之间，具有无法结合所述分子马达的间隔区。13.根据权利要求11所述的衔接子分子，其特征在于，在与所述生物分子直接或间接地结合的端部的相反侧的端部，具备与所述生物分子的分析装置中的纳米孔的直径相比直径更大的防脱落部。14.根据权利要求13所述的衔接子分子，其特征在于，所述防脱落部为能与所述单链核酸区域结合的分子或在所述单链核酸区域内的互补区域形成的发夹结构。
15.根据权利要求11所述的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与所述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于所述一个端部的另一个端部连接、末端为3
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末端、且具有所述分子马达结合部和所述引物结合部的多个组。16.根据权利要求11所述的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与所述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及一对单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于所述一个端部的另一个端部连接、且由彼此不互补的碱基序列构成，所述分子马达结合部和所述引物结合部的多个组位于这一对单链核酸区域中具有3
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末端的单链核酸区域内。17.根据权利要求16所述的衔接子分子，其特征在于，所述一对单链核酸区域中具有5
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末端的单链核酸区域具有立体结构形成区域。18.根据权利要求17所述的衔接子分子，其特征在于，具备相对于所述立体结构形成区域的至少一部分具有互补的碱基序列的立体结构形成抑制寡聚体。19.根据权利要求18所述的衔接子分子，其特征在于，所述立体结构形成抑制寡聚体与所述立体结构形成区域的至少一部分进行了杂交，相比于立体结构形成抑制寡聚体进行了杂交的部分更靠近末端的一侧为单链。20.根据权利要求16所述的衔接子分子，其特征在于，所述一对单链核酸区域中具有5
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末端的单链核酸区域具有与分子马达的结合力比所述生物分子低的分子马达脱离诱导部。21.一种衔接子分子，其能与分析对象的生物分子直接或间接地结合，且具有与分子马达的结合力比所述生物分子低的分子马达脱离诱导部。22.根据权利要求21所述的衔接子分子，其特征在于，所述分子马达脱离诱导部为不具有磷酸二酯键的碳链或脱碱基序列部。23.根据权利要求21所述的衔接子分子，其特征在于，在相比于所述分子马达脱离诱导部更靠近5
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末端的一侧进一步具有由单链核苷酸构成的立体结构形成区域。24.根据权利要求21所述的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与所述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于所述一个端部的另一个端部连接、末端为5
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末端、且具有所述分子马达脱离诱导部。25.根据权利要求21所述的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与所述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及一对单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于所述一个端部的另一个端部连接、且由彼此不互补的碱基序列构成，所述分子马达脱离诱导部位于这一对单链核酸区域中具有5
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末端的单链核酸区域内。26.根据权利要求23所述的衔接子分子，其特征在于，具备相对于所述立体结构形成区
域的至少一部分具有互补的碱基序列的立体结构形成抑制寡聚体。27.根据权利要求26所述的衔接子分子，其特征在于，所述立体结构形成...

【专利技术属性】
技术研发人员：赤堀玲奈，后藤佑介，藤冈满，柳至，
申请(专利权)人：株式会社日立高新技术，
类型：发明
国别省市：