实现转基因玉米2A-7转化事件特异定性PCR检测的扩增引物及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种实现转基因玉米2A

【技术实现步骤摘要】
实现转基因玉米2A
‑
7转化事件特异定性PCR检测的扩增引物及检测方法


[0001]本专利技术涉及PCR检测
，具体涉及的是一种实现转基因玉米2A
‑
7转化事件特异定性PCR检测的扩增引物及检测方法。

技术介绍

[0002]据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)报道，2019年全球29个国家总共种植了1.904亿公顷的转基因作物，对全球粮食安全、可持续性、减缓气候变化做出了重大贡献。全球前五的转基因作物种植国家分别是美国、巴西、阿根廷、加拿大和印度，主要种植的转基因作物为大豆、玉米、棉花和油菜。
[0003]当前，随着转基因作物种植面积的持续增长和全球公众对于转基因植物及其产品安全性的关注度不断提升，包括我国在内的全球50多个国家和地区颁布实施了转基因生物标识管理制度，针对转基因作物转化体建立特异、灵敏、标准化的检测方法是保证标识管理制度顺利实施的重要技术支撑。
[0004]转基因玉米2A
‑
7是中国农业大学自主研发的转基因玉米新品种，该品种通过农杆菌侵染的方法把抗鞘翅目害虫基因mCry1Ab和mCry2Ab转入到具有高效转化效率的玉米自交系杂交组合HiII中，用筛选标记基因bar进行筛选，然后通过回交导入到郑58的自交系获得转基因玉米2A
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7，修饰后的mCry1Ab和mCry2Ab抗虫基因共同作用能够有效抑制抗性种群产生。该转化体已经进入生产性试验，在我国具有重要产业化应用前景。
[0005]目前，转基因玉米2A
‑
7的检测方法主要采用基于核酸的定性PCR检测方法，以及定量PCR检测方法(如申请人设计的转基因玉米2A
‑
7品系特异PCR精准定量检测的引物组以及检测方法，公开号：CN112980930A)，其中，定性PCR检测由于操作简便、效率高、成本低等优点而广泛应用于各检测机构。
[0006]然而，已有的针对转基因玉米2A
‑
7的定性PCR检测方法并不能真正地满足检测需要，如公开号为：CN112280743A所公开的“玉米事件2A
‑
7及其鉴定方法”，主要原因在于：(1)设计的引物存在对其他作物或其他作物混合物有扩增的情况，易导致检测结果不准确；(2)没有进行反应体系及反应条件的优化，无法达到PCR法最佳的扩增效率。
[0007]所以，设计一种高特异性、高扩增效率、高灵敏度的定性PCR检测方法，以便能够满足转基因玉米2A
‑
7的定性PCR检测，便成为本领域技术人员亟需解决的主要问题之一。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种实现转基因玉米2A
‑
7转化事件特异定性PCR检测的扩增引物及检测方法，从而满足转基因玉米2A
‑
7的定性PCR检测。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0010]实现转基因玉米2A
‑
7转化事件特异定性PCR检测的引物，包括两条转基因玉米2A
‑
7转化体的特异性序列扩增引物：
[0011]2A
‑
7F：CGTGGACGGCCTTCATAG
[0012]2A
‑
7R：TGATTAGAGTCCCGCAATTATAC；
[0013]其中，扩增引物的位置为转基因玉米2A
‑
7转化体的RB端侧翼，目的片段长度为166bp。
[0014]基于上述扩增引物，本专利技术提供了转基因玉米2A
‑
7转化事件的特异定性PCR检测方法，包括以下步骤：
[0015](1)制备DNA模板；
[0016](2)按照下表配置PCR反应体系：
[0017]试剂终浓度体积ddH2O —10
×
PCR缓冲液1
×
2.5μL25mmol/L氯化镁溶液1.5mmol/L1.5μLdNTPs混合溶液(各2.5mmol/L)0.2mmol/L2.0μL10μmol/L 2A
‑
7F0.4μmol/L1.0μL10μmol/L 2A
‑
7R0.4μmol/L1.0μLTaq DNA聚合酶0.025U/μL—25mg/L DNA模板2.0mg/L2.0μL总体积 25.0μL
[0018]表中，“—”表示体积不确定，如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据Taq酶的浓度确定其体积，并相应调整ddH2O的体积，使反应体系总体积达到25.0μL；
[0019](3)根据配置的PCR反应体系进行PCR反应，获得PCR扩增产物：
[0020](4)利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行定性检测，检测下限为0.1％。
[0021]具体地，所述步骤(1)中，制备DNA模板的制备过程为：将100％的2A
‑
7标准样品DNA稀释到25ng/μL。
[0022]具体地，所述步骤(3)包括以下步骤：
[0023](3a)将PCR反应体系于94℃条件下变性5min；
[0024](3b)再继续于94℃条件下变性30s；
[0025](3c)于58℃条件下退火30s；
[0026](3d)于72℃条件下延伸30s；
[0027](3e)循环步骤(3b)～(3d)35次；
[0028](3f)于72℃条件下延伸7min，获得PCR扩增产物。
[0029]具体地，所述步骤(4)包括以下步骤：
[0030](4a)称取3g琼脂糖，加入150mlTAE缓冲液及30μL Biotium GelRed核酸染料，配制2％琼脂糖凝胶；
[0031](4b)将PCR扩增产物和Marker分别上样5μL，并在90V电压条件下电泳70min，取出凝胶，放入BIO
‑
RAD凝胶成像系统进行图像采集，完成PCR扩增产物的检测。
[0032]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0033]本专利技术通过对插入位点的玉米基因组序列及载体序列和目的片段进行分析，设计了1对扩增效率好、特异性高、灵敏度好的扩增引物(2A
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7F、2A
‑
7R)，并建立了PCR检测方法，
实现了针对转基因玉米2A
‑
7高特异性、高扩增效率、高灵敏度的定性PCR检测。
[0034]并且，在设计的扩增引物的基础上，本专利技术对PCR检测方法中的关键因子反应体系及反应条件进行了优化。优化后的检测方法经测试验证，其检测下限(LOD)为0.1％，且不同仪器及不同检测人员对比方法重现性好，完全达到了国际先进水平。
[0035]因此，本专利技术所设计的扩增引物及PCR检测方法完全可以满足转基因玉米2A
‑
7的检测要求，为后续相关研究打下了良好的基础。
附本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.实现转基因玉米2A
‑
7转化事件特异定性PCR检测的扩增引物，其特征在于，包括两条转基因玉米2A
‑
7转化体的特异性序列扩增引物：2A
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7F：CGTGGACGGCCTTCATAG2A
‑
7R：TGATTAGAGTCCCGCAATTATAC；其中，扩增引物的位置为转基因玉米2A
‑
7转化体的RB端侧翼，目的片段长度为166bp。2.一种转基因玉米2A
‑
7转化事件的特异定性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备DNA模板；(2)按照下表配置PCR反应体系：试剂终浓度体积ddH2O—10
×
PCR缓冲液1
×
2.5μL25mmol/L氯化镁溶液1.5mmol/L1.5μLdNTPs混合溶液(各2.5mmol/L)0.2mmol/L2.0μL10μmol/L 2A
‑
7F0.4μmol/L1.0μL10μmol/L 2A
‑
7R0.4μmol/L1.0μLTaq DNA聚合酶0.025U/μL—25mg/L DNA模板2.0mg/L2.0μL总体积25.0μL表中，“—”表示体积不确定，如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据Taq酶的浓度确定其体积，并相应调整ddH2O的体积，使反应体系总体积达到25...

【专利技术属性】
技术研发人员：常丽娟，刘文娟，赵海铭，宋君，王东，代晓航，魏超，熊梅，
申请(专利权)人：四川省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：