添加了功能性碱基序列的靶标编辑指导RNA制造技术

本发明专利技术提供指导RNA。一种指导RNA，其是用于编辑靶标RNA序列的指导RNA，其包含与该靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列。ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列。ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】添加了功能性碱基序列的靶标编辑指导RNA


[0001]本专利技术涉及用于诱导ADAR、进行靶标RNA编辑的指导RNA，特别是添加了功能性碱基序列的指导RNA。

技术介绍

[0002]在生物体内存在基于单碱基突变的RNA编辑机制。特别是通过腺苷(A)的脱氨基化而转变为肌苷(I)的RNA编辑最为常见，靶标数高达400万。作为以双链RNA为底物进行由腺苷向肌苷的编辑的酶，已知有ADAR(Adenosine deaminases acting on RNA，RNA特异性腺苷脱氨酶)。ADAR存在基因不同的3种亚型(ADAR1、ADAR2、ADAR3)，任一亚型均在其N末端具有双链RNA结合结构域、在其C末端具有脱氨酶结构域。
[0003]ADAR2特别是在中枢神经系统中高效率地编辑构成3
‑
氨基
‑3‑
羟基
‑5‑
甲基
‑4‑
异唑丙酸(AMPA)型谷氨酸受体的亚单位2(GluR2)(Nature、1996、Vol.379、p.460
‑
464(非专利文献1))。
[0004]由腺苷转变而成的肌苷与鸟苷结构类似，因此在翻译阶段被识别为鸟苷并置换编码区的氨基酸。还报道了作为非编码区的逆转录转座子(FEBS Letters、2006、Vol.580、p.2301
‑
2305)、微小RNA(miRNA)前体也会成为ADAR的底物，暗示了在生物体内承担着多种功能的可能性(Ann.Rev.Biochem.、2010、Vol.79、p.321
‑
349)。
[0005]ADAR的改造体也有报道，例如，报道了一种ADAR的改造体，其通过在ADAR中引入突变而不仅能够识别腺苷、也能够识别胞苷，还能够进行通过胞苷的脱氨基化变为尿苷的、由C向U的RNA编辑(Science、2019、Vol.365、p.382
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386)。
[0006]近年来报道了使用野生型ADAR和人工指导RNA的RNA编辑。
[0007]例如，作为将作为人工合成核酸的反义寡核苷酸用作指导RNA的RNA编辑技术，使用与包含编辑靶标腺苷的mRNA互补的35个碱基长度以上的单链RNA、与mRNA形成不完全螺旋结构的双链并募集ADAR的技术是已知的，已有报道(国际公开第2017/220751号、国际公开第2018/041973号、国际公开第2018/134301号)。另外，报道了一种靶标RNA编辑指导RNA，其包含：含有与靶标RNA的一部分互补的反义序列的靶向区域及来源于GluR2的ADAR募集区域这2个区域的寡核苷酸构建体(专利文献1)。另外报道了：通过在野生型ADAR2表达细胞株中表达基于GluR2序列设计的指导RNA而诱导了一定的RNA编辑(Nucleic Acids Research、2017、Vol.45、p.2797
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2808(非专利文献2)、专利文献2及3)；使用由修饰寡核苷酸构成的指导RNA编辑了内源性靶标(Nat.Biotechnol.、2019、Vol.37、p.133
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138(非专利文献3))。
[0008]进而报道了一种指导RNA，其为包含与靶标RNA结合的反义区域及ADAR募集区域的位点特异性靶标RNA编辑指导RNA，其中，ADAR募集区域为49个碱基长度或40个碱基长度(Scientific Reports、2017、Vol.7、p.41478(非专利文献4)、专利文献4)。最近报道了一种靶标编辑指导RNA，其具备用于确定靶标RNA的第一寡核苷酸和连接在第一寡核苷酸的3
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侧的2～34个碱基长度的第二寡核苷酸(专利文献5)。根据该专利文献5认为，若第二寡核苷酸的残基数为14以上，则形成稳定的茎环结构、可维持编辑活性。
[0009]对于在指导RNA等RNA中添加碱基序列，已经有一些报道。
[0010]例如，已知可被小分子RNA(small RNA)识别的作为核酸高级结构的茎环结构有助于翻译调节功能(Cell.Mol.LifeSci.、2006、Vol.63、p.901
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908)。来源于λ噬菌体的BoxB序列采取茎环结构，与λN蛋白显示出强亲和性(Biol.Cell.、2008、Vol.100、p.125
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138、J.Am.Chem.Soc.、2002、Vol.124、p.10966
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10967)。报道了：为了利用该性质将ADAR募集到指导RNA，在指导RNA中添加BoxB序列，使λN蛋白与ADAR融合(Nucleic Acids Research、2016、Vol.44、p.e157(非专利文献6))。专利文献2记载了：为了使基于GluR2序列设计的指导RNA稳定化，可以在指导RNA的3
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末端添加BoxB序列，但是非专利文献2记载了通过向指导RNA中添加BoxB序列而带来的稳定化效果较为微弱。
[0011]鸟嘌呤四链体(Gq：G
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quadruplex)结构是作为在生物体内的环境中热力学稳定的DNA或RNA高级结构而已知的、包含鸟嘌呤的重复序列。高级结构的形成中需要一价阳离子。Gq原本是作为在端粒中可见的序列而进行报道的(Cell、1989、Vol.59、p.871
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880)。作为Gq的功能，已知转录、翻译、表观基因组控制等(EMBO Reports、2015、Vol.16、p.910
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922)。据报道，通过对Cas9的指导RNA的3
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末端添加Gq，基因组编辑效率提高(Chem.Commun.、2018、Vol.54、p.2377
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2380(非专利文献5))。
[0012]U6核内小分子RNA(small nuclear(sn)RNA)为在全部人类细胞中稳定且大量表达的小分子RNA(small RNA)，在核内形成核糖核蛋白U6snRNP。U6 snRNP构成剪接体，控制RNA前体中的剪接。已知U6上游的转录起始元件为能够使任意RNA(核酶、反义核糖核酸、RNA适配体等)表达的强力的polIII型启动子(Gene Ther.、1997、Vol.4、p.45
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54)。据报道，由U6所编码的序列制作的small RNA表达盒中，U6序列的高级结构发挥作用，使插入的RNA局部存在于核内(Gene Ther.、1997、Vol.4、p.45
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54(非专利文献7)、Nat.Biotechnol.、2002、Vol.20、p.505
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508(非专利文献8)、Mol.Ther.、2003、Vol.7、p.237
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247(非专利文献9))。
[0013]可见，关于使用人工指导RNA的RNA编辑，已有一些报道。但是，为了将靶标RNA编辑指导RNA用作药品，需要在细胞中显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种指导RNA，其是用于编辑靶标RNA序列的指导RNA，其包含与该靶标RNA序列的一部分互补的反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列。2.根据权利要求1所述的指导RNA，其中，反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5
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侧向3
’
侧进行了连接。3.根据权利要求2所述的指导RNA，其中，在反义碱基序列的5
’
侧还连接有至少1个功能性碱基序列。4.根据权利要求1所述的指导RNA，其还包含接头碱基序列。5.根据权利要求4所述的指导RNA，其中，在短链型ADAR募集碱基序列上通过接头碱基序列连接有至少1个功能性碱基序列。6.根据权利要求5所述的指导RNA，其中，反义碱基序列、短链型ADAR募集碱基序列、接头碱基序列和至少1个功能性碱基序列按照该顺序从5
’
侧向3
’
侧进行了连接。7.根据权利要求6所述的指导RNA，其中，在反义碱基序列的5
’
侧还连接有至少1个功能性碱基序列。8.根据权利要求1～7中任一项所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为与指导RNA的细胞内稳定化和/或细胞内的局部存在有关的碱基序列。9.根据权利要求1～8中任一项所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为选自形成鸟嘌呤四链体结构的碱基序列和形成茎环结构的碱基序列中的1种以上碱基序列。10.根据权利要求1～8中任一项所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为U6 snRNA序列。11.根据权利要求9所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为形成1～4层的鸟嘌呤四链体结构的碱基序列。12.根据权利要求9所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列为形成茎环结构的碱基序列。13.根据权利要求12所述的指导RNA，其中，形成茎环结构的碱基序列为来源于BoxB序列的碱基序列。14.根据权利要求1～13中任一项所述的指导RNA，其中，功能性碱基序列由序列号6、7、8或9所示的碱基序列或者在该碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～3个碱基且具有功能的碱基序列构成。15.根据权利要求1～14中任一项所述的指导RNA，其中，短链型ADAR募集碱基序列为由14～34个碱基构成...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉见英治，森家由香里，万田茉莉子，福田将虎，
申请(专利权)人：学校法人福冈大学，
类型：发明
国别省市：