一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建方法及应用，属于病毒技术领域。本发明专利技术通过分段扩增的方法将新型鹅细小病毒SD株的完整基因组克隆至质粒pBluescript II SK，获得重组质粒；同时利用重叠PCR技术将基因组中NcoⅠ位点突变，作为鉴定野毒与拯救病毒的遗传标记；然后将重组质粒与转染试剂混合，通过卵黄囊与尿囊腔途径接种SPF鸭胚，获得拯救病毒。本发明专利技术建立的新型鹅细小病毒反向遗传操作系统，可用于新型鹅细小病毒毒力分析、跨种传播机制等方向的研究，同时也为研究鸭短喙与侏儒综合征的新型疫苗奠定了基础。新型疫苗奠定了基础。新型疫苗奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于病毒
，尤其涉及一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]2015年以来，我国江苏、山东、河北等地区商品肉鸭群(樱桃谷鸭与北京鸭等)发生了不明原因的以雏鸭发育迟缓，上下喙萎缩，舌头外伸、肿胀、向下弯曲为特征的疾病，俗称为鸭“短喙与侏儒综合征”(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)。该病发病率为10％～30％，严重时可达50％以上，患鸭出栏体重较健康鸭降低20％～30％，严重者仅为正常体重的50％。感染鸭群料肉比显著升高，出栏合格率下降，在抓扑、屠宰过程中喙部、翅部骨骼和胫骨等易发生骨折。疾病发生后本实验室以及国内多个实验室先后证实该病为传染性疾病，其病原为水禽细小病毒，因该病毒跟小鹅瘟(鹅细小病毒)同源性很高(92.7％～97.3％)，故也称之为鸭源鹅细小病毒、鹅细小病毒变异株或新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)；同时因其跟番鸭细小病毒同源性较高(81.1％～85.0％)，曾也被称为新型鸭细小病毒，本研究中统一称之为NGPV。1971与1995年，法国与波兰的半番鸭中有发生该病的报道，直到2009年才最终确定病原为NGPV。目前，该病仍在我国养鸭地方广泛发生与流行，同时出现鸭“异常换羽”等临床表现以及半番鸭(表现短喙与侏儒)与鸵鸟(表现为瘫痪，本课题组首次发现)等家禽感染；该病既可通过消化道途径水平传播，也可通过种鸭/种蛋垂直传播，给我国家禽业造成了巨大经济损失。
[0003]疫病发生后，本课题组2015年从患有SBDS的樱桃谷鸭体内分离到NGPV SD株，该病毒可在鸭胚或鸭胚成纤维细胞(DEF)上增殖，易感鹅胚或鹅胚成纤维细胞(GEF)也可以增殖。
[0004]NGPV与番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)同属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒亚科(Parvovirinae)依赖病毒属(Dependovirus)成员。在电镜下NGPV病毒粒子分为实心和空心两种形态，直径为20～24nm，无囊膜，正二十面体对称。NGPV为单股链状DNA病毒，基因组全长约5.1kb，含有两个相同的末端重复序列(ITR)和两个开放阅读框(ORF)。ITR对病毒的复制和包装起着重要的作用。左侧开放阅读框编码非结构蛋白NS1及其mRNA剪切后产生的NS2，NS1与NS2共同参与病毒的复制与转录。右侧开放阅读框编码通过使用不同的起始密码子和蛋白质水解酶裂解编码三种结构蛋白，VP1、VP2、VP3，这三种结构蛋白以1:1:8的比例构成二十面体衣壳。
[0005]反向遗传操作技术的基本过程是先获得病毒的全基因组，将其组装至适宜载体上，将构建好的全长质粒通过转染至易感细胞，进而拯救出具有感染性的病毒。反向遗传学技术是开展病毒研究的一个有效的平台，可通过操纵基因组的变化，从而影响相应的表观变化，以此判断这些操作对病毒的影响。建立新型鹅细小病毒的反向遗传操作系统，以此为基础可以对新型鹅细小病毒的毒力、跨种传播机制等开展研究，同样也可对相关疫苗的研
究提供一个有用的平台，但是目前尚未有相关研究和报道。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建及其拯救方法，建立了新型鹅细小病毒的反向遗传学操作系统，为今后进行该病毒的毒力研究、跨种传播机制、相关疫苗研制等提供了技术保障。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的制备用引物，具体序列如SEQ ID No.1～14所示。
[0009]本专利技术还提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的分子标记引物，具体序列如SEQ ID No.15～16所示。
[0010]本专利技术还提供了一种含有基因序列如SEQ ID No.1～16所示的引物组合的试剂盒。
[0011]本专利技术还提供了一种针对致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株的拯救系统，包括A、B、C1、C2
‑
1、C2
‑
2、D、E七个片段的扩增产物和两种质粒。
[0012]优选的，所述质粒为pSK
‑
XBSE和pBluescript II SK。
[0013]本专利技术还提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：
[0014](1)构建克隆C片段的中间质粒pSK
‑
XBSE：选取载体pBluescript II SK，合成基因片段，进行多克隆位点改造，获得含如SEQ ID NO.17所示基因片段的pBluescript II SK质粒，然后转化、培养、鉴定，将阳性菌进行扩繁，提取质粒，作为中间质粒，并命名为pSK
‑
XBSE；
[0015](2)提取NGPV SD第F5代病毒基因组总DNA；
[0016](3)设计、合成覆盖NGPV SD病毒全基因组的六对重叠引物SegA
‑
F、SegA
‑
R、SegB
‑
F、SegB
‑
R、SegC1
‑
F、SegC1
‑
R、SegC2
‑
F、SegC2
‑
R、SegD
‑
F、SegD
‑
R、SegE
‑
F、SegE
‑
R，其中SegA
‑
F含有与pBluescript II SK质粒的同源臂，SegA
‑
R含有与pBluescript II SK质粒的同源臂与Sph
ꢀⅠ
、Bcl
ꢀⅠ
限制性内切酶酶切位点，SegE
‑
F含有与pBluescript II SK质粒的同源臂，SegE
‑
R含有与pBluescript II SK质粒的同源臂与Sph
ꢀⅠ
限制性内切酶酶切位点，各引物序列如SEQ ID NO.1～12所示；在C2片段中引入遗传标记ΔNco
ꢀⅠ
，突变引物为1
‑
R、2
‑
F，突变引物序列如SEQ ID NO.13～14所示；为扩增含有Nco
ꢀⅠ
酶切位点的片段设计rSD
‑
F、rSD
‑
R引物，具体序列如SEQ ID NO.15～16所示；
[0017](4)分别以SegA
‑
F/SegA<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的制备用引物，其特征在于，具体序列如SEQ ID No.1～14所示。2.一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的分子标记引物，其特征在于，具体序列如SEQ ID No.15～16所示。3.一种含有基因序列如SEQ ID No.1～16所示的引物组合的试剂盒。4.一种针对致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株的拯救系统，其特征在于，包括A、B、C1、C2
‑
1、C2
‑
2、D、E七个片段的扩增产物和两种质粒。5.如权利要求4所述的拯救系统，其特征在于，所述质粒为pSK
‑
XBSE和pBluescript II SK。6.一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建克隆C片段的中间质粒pSK
‑
XBSE：选取载体pBluescript II SK，合成基因片段，进行多克隆位点改造，获得含如SEQ ID NO.17所示基因片段的pBluescript II SK质粒，然后转化、培养、鉴定，将阳性菌进行扩繁，提取质粒，作为中间质粒，并命名为pSK
‑
XBSE；(2)提取NGPV SD F5代病毒基因组总DNA；(3)设计、合成覆盖全基因组的引物：根据NGPV SD全基因序列，依据选取的酶切位点设计相应引物，包括六对扩增引物SegA
‑
F、SegA
‑
R、SegB
‑
F、SegB
‑
R、SegC1
‑
F、SegC1
‑
R、SegC2
‑
F、1
‑
R、2
‑
F、SegC2
‑
R、SegD
‑
F、SegD
‑
R、SegE
‑
F、SegE
‑
R，一对突变引物1
‑
R、2
‑
F以及合成Nco
ꢀⅠ
突变位点的分子标记引物rSD
‑
F、rSD
‑
R；所述扩增引物序列如SEQ ID No.1～12所示，所述突变引物序列如SEQ ID No.13～14所示，所述分子标记引物序列如SEQ ID No.15～16所示；(4)各基因片段的PCR扩增：首先以NGPV SD全基因为模板，利用引物SegA
‑
F/SegA
‑
R、SegB
‑
F/SegB
‑
R、SegC1
‑
F/SegC1
‑
R、SegC2
‑
F/1
‑
R、2
‑
F/SegC2
‑
R、SegD
‑
F/SegD
‑
R、SegE
‑
F/SegE
‑
R进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行检测和纯化回收，得到A、B、C1、C2
‑
1、C2
‑
2、D、E七个片段；然后以C2
‑
1与C2
‑
2回收产物为模板，以SegC2
‑
F/SegC2
‑
R为引物进行重叠PCR扩增，对目的产物进行回收，得到C2片段。(5)分阶段构建重组质粒pSK
‑
SD：
①
pSK
‑
A质粒的构建：将质粒pBluescript
ꢀⅡꢀ
SK使用Xho
ꢀⅠ
与EcoR
ꢀⅠ
进行双酶切获得目的产物，然后与A片段进行同源重组，转化至JM110感受态细胞中处理、培养获得阳性菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，命名为pSK
‑
A；
②
pSK
‑
E质粒的构建：将质粒pBluescript
ꢀⅡꢀ
SK使用EcoR
ꢀⅠ
与Not
ꢀⅠ
进行双酶切获得目的产物，然后与E片段进行同源重组，转化至DH5α感受态...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁万哲，郝雪飘，赵款，雷白时，薛拥志，张武超，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：