【技术实现步骤摘要】
一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建方法及应用
[0001]本专利技术属于病毒
，尤其涉及一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建方法及应用。
技术介绍
[0002]2015年以来，我国江苏、山东、河北等地区商品肉鸭群(樱桃谷鸭与北京鸭等)发生了不明原因的以雏鸭发育迟缓，上下喙萎缩，舌头外伸、肿胀、向下弯曲为特征的疾病，俗称为鸭“短喙与侏儒综合征”(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)。该病发病率为10％～30％，严重时可达50％以上，患鸭出栏体重较健康鸭降低20％～30％，严重者仅为正常体重的50％。感染鸭群料肉比显著升高，出栏合格率下降，在抓扑、屠宰过程中喙部、翅部骨骼和胫骨等易发生骨折。疾病发生后本实验室以及国内多个实验室先后证实该病为传染性疾病，其病原为水禽细小病毒，因该病毒跟小鹅瘟(鹅细小病毒)同源性很高(92.7％～97.3％)，故也称之为鸭源鹅细小病毒、鹅细小病毒变异株或新型鹅细小病毒(Novel goose ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的制备用引物，其特征在于，具体序列如SEQ ID No.1～14所示。2.一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的分子标记引物，其特征在于，具体序列如SEQ ID No.15～16所示。3.一种含有基因序列如SEQ ID No.1～16所示的引物组合的试剂盒。4.一种针对致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株的拯救系统，其特征在于，包括A、B、C1、C2
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1、C2
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2、D、E七个片段的扩增产物和两种质粒。5.如权利要求4所述的拯救系统，其特征在于，所述质粒为pSK
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XBSE和pBluescript II SK。6.一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建克隆C片段的中间质粒pSK
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XBSE：选取载体pBluescript II SK，合成基因片段，进行多克隆位点改造，获得含如SEQ ID NO.17所示基因片段的pBluescript II SK质粒，然后转化、培养、鉴定，将阳性菌进行扩繁，提取质粒，作为中间质粒，并命名为pSK
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XBSE；(2)提取NGPV SD F5代病毒基因组总DNA；(3)设计、合成覆盖全基因组的引物：根据NGPV SD全基因序列，依据选取的酶切位点设计相应引物，包括六对扩增引物SegA
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F、SegA
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R、SegB
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F、SegB
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R、SegC1
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F、SegC1
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R、SegC2
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F、1
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R、2
‑
F、SegC2
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R、SegD
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F、SegD
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R、SegE
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F、SegE
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R，一对突变引物1
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R、2
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F以及合成Nco
ꢀⅠ
突变位点的分子标记引物rSD
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F、rSD
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R；所述扩增引物序列如SEQ ID No.1～12所示，所述突变引物序列如SEQ ID No.13～14所示，所述分子标记引物序列如SEQ ID No.15～16所示；(4)各基因片段的PCR扩增：首先以NGPV SD全基因为模板，利用引物SegA
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F/SegA
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R、SegB
‑
F/SegB
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R、SegC1
‑
F/SegC1
‑
R、SegC2
‑
F/1
‑
R、2
‑
F/SegC2
‑
R、SegD
‑
F/SegD
‑
R、SegE
‑
F/SegE
‑
R进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行检测和纯化回收，得到A、B、C1、C2
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1、C2
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2、D、E七个片段；然后以C2
‑
1与C2
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2回收产物为模板，以SegC2
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F/SegC2
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R为引物进行重叠PCR扩增，对目的产物进行回收，得到C2片段。(5)分阶段构建重组质粒pSK
‑
SD：
①
pSK
‑
A质粒的构建：将质粒pBluescript
ꢀⅡꢀ
SK使用Xho
ꢀⅠ
与EcoR
ꢀⅠ
进行双酶切获得目的产物，然后与A片段进行同源重组，转化至JM110感受态细胞中处理、培养获得阳性菌落，经过测序证实连接成功后将其进行扩繁，提取质粒，命名为pSK
‑
A；
②
pSK
‑
E质粒的构建：将质粒pBluescript
ꢀⅡꢀ
SK使用EcoR
ꢀⅠ
与Not
ꢀⅠ
进行双酶切获得目的产物，然后与E片段进行同源重组，转化至DH5α感受态...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁万哲，郝雪飘，赵款，雷白时，薛拥志，张武超，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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