一种广谱抗菌肽及其在皮肤损伤修复中的应用制造技术

本发明专利技术通过生物信息学分析，对美洲大蠊防御肽进行特殊位点的突变，通过建模的方式分析突变体的理化性质，择优采用固相合成法合成突变体抗菌肽，并进行质谱鉴定和抑菌活性检测，获得稳定性提升并且同时具有抗菌功能的突变体抗菌肽。其中，PD

【技术实现步骤摘要】
一种广谱抗菌肽及其在皮肤损伤修复中的应用


[0001]本专利技术涉及多肽领域，更为具体地，本专利技术涉及一种小分子抗菌肽及其应用。

技术介绍

[0002]抗菌肽(Antimicrobial peptides)也称防御肽，由生物体多种细胞的特定基因编码，是机体抵御细菌、病毒、真菌、原虫，抑杀肿瘤细胞的第一道防线。抗菌肽因其不易产生耐药性、广谱抗菌、低细胞毒性、热稳定性好等特点，有望替代抗生素在临床上使用。昆虫是种群最大的生物种类,抗菌肽的数量难以估量。现在,仅在鳞翅目、双翅目、鞘翅目和蜻蜓目等8个目的昆虫中发现超过200多种昆虫抗菌肽类物质,仅从家蚕这一种昆虫获得了40个抗菌肽基因。抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视。除此之外，人们还发现，某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程。抗菌肽的广泛的生物学活性显示了其在医学上良好的应用前景。美洲大蠊其自然生活条件恶劣，有研究表明美洲大蠊具有高度多样的抗菌肽，然而目前对于美洲大蠊体内抗菌肽的分离及其功能研究还远远不足。
[0003]在早前的研究中，已有多种来自美洲大蠊的防御肽被发现，然而其中很大一部分由于稳定性不佳无法用于药用，因此，对天然抗菌肽进行分子结构改造、化学修饰以及重新设计是挖掘和开发新型抗菌肽的一个重要研究方向。

技术实现思路

[0004]本专利技术为了填补现有技术的空白，旨通过对天然美洲大蠊抗菌肽进行分子结构改造，从而提高天然抗菌肽的稳定性和抑菌活性。为此，本专利技术提供了如下的技术方案：
[0005]本专利技术的第一个方面，提供一种广谱抗菌肽，所述抗菌肽是通过将SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列中的一个或多个位置的赖氨酸突变为组氨酸获得。
[0006]在一种优选的实施方式中，所述位置为第44、68、90处的一个或多个位置。
[0007]本专利技术的第二个方面，提供上述广谱抗菌肽在制备抗感染药物中的应用。
[0008]本专利技术的第三方面，提供上述广谱抗菌肽在制备用于治疗皮肤损伤药物中的应用。
[0009]在一种实施方式中，上述药物为外用制剂。
[0010]作为一种优选方式，上述外用制剂选自喷剂或擦剂。
[0011]在一种实施方式中，上述外用制剂为乳剂、膏剂、悬浮剂等。
[0012]本专利技术相对于现有技术获得了如下有益的技术效果：
[0013]本专利技术通过生物信息学分析，对美洲大蠊防御肽进行特殊位点的突变，通过建模的方式分析突变体的理化性质，择优采用固相合成法合成突变体抗菌肽，并进行质谱鉴定和抑菌活性检测，获得稳定性提升并且同时具有抗菌功能的突变体抗菌肽。其中，PD
‑
1m1和PD
‑
1m8均具有广谱抗菌活性，而PD
‑
1m7对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌显示出极强的抑
菌活性。该系列突变体多肽有望替代抗生素用于制备皮肤修复类药物，具有良好的药用价值前景。
具体实施方式
[0014]以下对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0015]实施例1 抗菌肽PD
‑
1m系列的设计
[0016]抗菌肽PD
‑
1m系列是基于来自美洲大蠊的天然抗菌肽的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)进行系列突变设计。为了提高抗菌肽的稳定性，根据天然抗菌肽的氨基酸序列组成及电荷性、疏水性进行分析，尝试将天然抗菌肽中的8个赖氨酸(Lys)中的部分或全部替换为组氨酸(His)，具体替换位点和各突变体的理化性质分析如表1所示。
[0017]表1
[0018][0019]由表1所示，通过对天然抗菌肽序列的赖氨酸位点进行突变，其中突变体多肽PD
‑
1m1、PD
‑
1m7、PD
‑
1m8、PD
‑
1m9、PD
‑
1m10五个多肽序列的稳定性均得到显著提升。
[0020]实施例2 抗菌肽突变体PD
‑
1m1、PD
‑
1m7、PD
‑
1m8、PD
‑
1m9、PD
‑
1m10的合成
[0021]称取Rink Amide MBHA树脂0.23g，置于PSI300型多肽合成仪反应器中，加入10mLDMF，浸泡2h，然后加入20％PIP/DMF溶液10mL，混合30min脱除氨基保护基，DMF洗涤树脂7次，然后向反应器中加入Fmoc
‑
L
‑3‑
(2
‑
Thienyl)L
‑
alanine
‑
OH、等摩尔的偶联试剂DIC(0.3mol/L)和HOBt(0.3mol/L)进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DMF洗涤树脂5次。当第一个氨基酸偶联到树脂上后，即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成。合成结束后，真空干燥树脂，称重。按照1mL裂解试剂/100mg树脂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFA:茴香硫醚:75％苯酚:水＝85:5:5:5，室温搅拌反应3小时，抽滤。之后向裂解抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清，再用冰乙醚反复洗涤沉淀4～5次，真空干燥，称重粗肽。
[0022]使用Waters600E色谱C18反相柱子纯化并收集纯度大于95％的部分(目标肽)，做ESI
‑
MS鉴定。
[0023]经ESI
‑
M3S测定，该系列突变体多肽的测定值如表2所示：
[0024]表2
[0025]突变体分子量(理论值)分子量(ESI
‑
MS实测值)PD
‑
1m116650.816648PD
‑
1m716659.716658PD
‑
1m816668.616667PD
‑
1m916677.516675PD
‑
1m1016713.116712
[0026]实施例3 系列突变体抗菌肽最小抑菌浓度检测(MIC检测)
[0027]本试验中最小抑菌浓度的检测采用微量稀释法，检测菌为大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、表皮葡萄球菌(ATCC12228)、枯草芽孢杆菌(ATCC6638)和肺炎克雷伯菌(ATCC700603)。具体方法为：将各菌种复苏，涂布于MH固体培养基，放置于37℃恒温培养箱过夜，挑单个菌落接种在新鲜的液体LB培养基里，重新置于37℃恒温培养箱过夜；然后借助于麦氏比浊仪用新鲜LB液体培养基把5种菌悬液稀释到105CF本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定性提升的广谱抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽是通过将SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列中的一个或多个位置的赖氨酸突变为组氨酸获得。2.如权利要求1所述的广谱抗菌肽，其特征在于，所述位置为第44、68、90处的一个或多个位置。3.如权利要求1所述的广谱抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽是通过将SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列中第44位的赖氨酸突变为组氨酸获得。4.如权利要求1所述的广谱抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽是通过将SEQ ID NO.:1所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄鹏，沈秀微，吴淑娟，胡斐，曲姝奕，
申请(专利权)人：温州医科大学慈溪生物医药研究院，
类型：发明
国别省市：