一种氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种氟化聚乙二醇

【技术实现步骤摘要】
一种氟化聚乙二醇
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聚乙烯亚胺及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，具体为一种氟化聚乙二醇
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聚乙烯亚胺及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]基因治疗是一种将外源性核酸导入目的细胞并发挥其生物学效应从而达到治疗目的的方法，为治疗遗传性的先天疾病和后天获得性疾病提供了一条新途径。在恶性肿瘤、家族性遗传病和心血管疾病等疾病的治疗方面，相比于传统疗法，基因治疗有望从根源上修正引起疾病的异常基因。基因治疗的研究和应用中，普遍采用的核酸分子有如：质粒、信使RNA(mRNA)、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)和双链RNA(dsRNA)等。其中，小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)主要参与RNA干扰现象，可以用于调节基因的表达。
[0003]RNA干扰(RNA interference，RNAi)是在真核生物中普遍存在的一种生物学现象，在进化过程中高度保守。具体是指由双链RNA(例如miRNA、piRNA或siRNA等)介导的，在特定酶参与下，mRNA发生高效特异性降解，在转录后水平上使特异性靶基因发生的沉默现象。正确运用RNAi技术可以特异性降低甚至关闭靶基因表达，这一特点使得该技术在生物医药领域被广泛应用，特别是其中有大量成果已经用于临床前研究或临床试验，并已有少量产品进入临床应用。
[0004]但是，外源性核酸难以直接被靶细胞摄取，需要依靠核酸递送载体完成细胞转染后才能发挥生物学效应，因此制备出能够携带功能核酸片段的载体，是转染技术应用的关键环节。核酸载体主要分为病毒载体以及非病毒载体。病毒载体主要包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒等，优点在于转染效率较高，但具有较高的免疫原性、核酸装载能力比较有限、大批量制备困难还有价格偏高等缺点，且存在较大的生物安全风险。非病毒载体具有成本低廉、制备简单、可修饰位点多等优点，但其缺点主要是转染效率较低、具有较高的细胞毒性等。目前已有许多商品化的非病毒载体，例如聚乙烯亚胺、Lipo2000、Lipo3000等。其中，聚乙烯亚胺(PEI)是现有技术常用的阳离子转染载体，分为直链型和支链型，可以与核酸分子自组装形成纳米颗粒，具有转染效率较高，含较多伯氨基可进一步化学修饰等优点；但由于PEI分子具有高正电性，在转染过程中易引发强烈的细胞毒性，生物相容性仍不理想。
[0005]为了解决聚乙烯亚胺的生物相容性问题，现有技术普遍采用聚乙二醇对其进行化学修饰。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)具有水溶性、柔顺性、无毒、免疫原性低和生物可降解等优点，在生物医学材料、药物领域有着广泛应用。纳米颗粒表面的PEG可以提供较大的空间位阻，提高纳米颗粒在生理环境下的稳定性，同时降低单核巨噬细胞系统的识别和摄取，延长纳米颗粒的体内循环时间。但是，现有技术表明，纳米颗粒的PEG化(PEGylation)产生了相应的缺点，例如PEG分子链的空间位阻作用抑制靶细胞对纳米颗粒的摄取，尤其是PEG修饰密度越高，细胞摄取率越低；再者，PEG化纳米载体被细胞摄取后的“内含体逃逸”(Endosomal escape)效率有所降低，导致其负载的核酸或蛋白类分子难以发挥生物学效应，这一系列负面作用被称为“PEG困境”。
[0006]现有技术中已有一些技术方法用于解决“PEG困境”。例如，可以利用腙键、席夫碱键或者二硫键等化学键连接PEG和纳米颗粒，在一定的环境下使得PEG可从纳米颗粒表面脱离，但无论是可断裂还是不可断裂的PEG修饰，仍会影响纳米颗粒的细胞摄取效率，且可断裂化学键能否如预期一样在有效的时间内、一定条件下使纳米颗粒脱PEG化依旧是技术上的难题。利用多肽或者抗体修饰在PEG化纳米颗粒表面可以利用受体介导的内吞作用提高细胞对纳米颗粒的摄取效率，还可以具备靶向性，但是可能存在脱靶效应，且多肽或抗体成本高昂，保存条件较为严苛，大规模应用仍存在困难。当下，如何解决“PEG困境”仍是前沿的研究重点。
[0007]现有技术中，含氟药物在市售药物中占有相当比例。引入氟原子或含氟基团的优势在于，可以调节药物的理化特性，提高药物的生物利用度，增强配体与靶标的相互结合能力，或者通过阻断易代谢位点进而提高药物代谢稳定性等。单氟原子取代基通常表现为弱疏水性，而当碳原子上有两个氟原子取代时，由于加和作用，则呈现出强疏水性。特别的，引入氟原子或含氟基团后可增强药物分子的亲脂性，使得含氟化合物在生物体内对膜、组织的穿透能力增加，从而提高了含氟化合物在生物体内的吸收和递送效率。
[0008]现有技术表明，磁性纳米颗粒可广泛应用于生物医药领域，例如：核酸提取、细胞分离、磁共振成像等。现有技术中，已有利用聚乙烯亚胺、聚赖氨酸等阳离子聚合物包覆磁性纳米颗粒构建磁性核酸载体的报道，这类磁性核酸载体相比单独的阳离子聚合物，其核酸递送效率显著提高。但是氟化的阳离子聚合物能否结合磁性纳米颗粒用于构建在生理环境下稳定的核酸载体仍不明确。此外，现有技术表明，纳米颗粒在组织穿透、细胞摄取以及代谢等方面有别于传统的药物分子，对磁性核酸载体表面结合的高分子聚合物进行氟化修饰能否提高载体细胞摄取效率或核酸递送效率目前尚不明确。

技术实现思路

[0009]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题在于提供了一种新型阳离子聚合物并利用该聚合物制备磁性核酸转染载体，具体是利用氟化聚乙二醇
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聚乙烯亚胺包覆四氧化三铁磁性纳米颗粒构建新型核酸纳米载体，用于核酸转染。这种阳离子聚合物的细胞毒性较低，生物相容性较好，并且该聚合物结合磁性纳米颗粒构建的载体易于被细胞摄取，还具备磁响应性，可利用磁场进一步提高核酸的转染效率。
[0010]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种氟化聚乙二醇
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聚乙烯亚胺化合物，所述氟化聚乙二醇
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聚乙烯亚胺化合物采用七氟丁酸酐与氨基
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聚乙二醇
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羧基反应制备氟化聚乙二醇
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羧基，再与聚乙烯亚胺通过酰胺键连接得到。
[0011]该氟化聚乙二醇
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聚乙烯亚胺化合物以一端为氨基且另一端为羧基的聚乙二醇衍生物为桥连，氨基端化学连接七氟丁酰基，羧基端化学连接聚乙烯亚胺。具体为采用七氟丁酸酐(分子式：C8O3F
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)与氨基
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聚乙二醇
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羧基(分子式：NH2‑
PEG
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COOH)为原料，利用七氟丁酸酐与氨基反应制备氟化聚乙二醇
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羧基，再与聚乙烯亚胺通过酰胺键连接，得到氟化聚乙二醇
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聚乙烯亚胺(F
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PEG
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PEI)。
[0012]本专利技术还提供了所述的氟化聚乙二醇
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聚乙烯亚胺的制备方法，包括以下步骤：
[0013](1)将七氟丁酸酐和氨基
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聚乙二醇
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羧基混本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氟化聚乙二醇
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聚乙烯亚胺化合物，其特征在于，所述氟化聚乙二醇
‑
聚乙烯亚胺化合物采用七氟丁酸酐与氨基
‑
聚乙二醇
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羧基反应制备氟化聚乙二醇
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羧基，再与聚乙烯亚胺通过酰胺键连接得到。2.权利要求1所述的氟化聚乙二醇
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聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将七氟丁酸酐和氨基
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聚乙二醇
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羧基混溶于甲醇中，在催化剂存在的条件下进行化学反应，纯化后得到氟化聚乙二醇
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羧基；（2）将氟化聚乙二醇
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羧基溶于水中，加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和N
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羟基琥珀酰亚胺用于活化羧基反应得到混合溶液；（3）反应结束后将上述混合溶液逐滴加入聚乙烯亚胺水溶液中，偶联得到氟化聚乙二醇
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聚乙烯亚胺。3.根据权利要求2所述的氟化聚乙二醇
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聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述七氟丁酸酐：氨基
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聚乙二醇
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羧基的摩尔比为=1:2～2:1，反应条件为室温下搅拌反应24
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72小时，透析纯化的方法为采用纯水透析3～6天，截留分子量为800～1000，过滤纯化的方法为采用孔径220～450nm滤膜过滤产物溶液。4.根据权利要求2所述的氟...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，曹逸祥，马明，王建国，
申请(专利权)人：徐州淮海生命科学产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：