一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法技术

本发明专利技术公开了一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，具体包括如下步骤：配制种子培养基，向种子培养基中接入汉氏驹形杆菌，培养获得液体发酵菌种，配制液体发酵培养基，将液体发酵菌种接入液体发酵培养基中，培养后结束发酵，将发酵液匀浆漂洗，再碱煮漂洗，烘干称重测定产量，计算发酵得率。其中，在使用通用式机械搅拌发酵罐动态发酵阶段，采用六平叶+BT6的优选搅拌桨组合可以有效地提高发酵罐K

【技术实现步骤摘要】
一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法。

技术介绍

[0002]细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是由醋酸杆菌和驹形杆菌等细菌产生的纤维素。相比于植物纤维素，BC不含半纤维素、木质素，具有纯度高、持水性强、可生物降解、生物相容性好、高比表面积等特性，应用广泛。BC的制备有静态培养和动态培养两种方式，静态培养制备的BC已在食品、医疗领域应用，但是静态培养发酵周期长、占地面积大限制其进一步发展。动态培养方式发酵周期短，但发酵产量低等问题使发酵成本较高，阻碍了其工业化生产，因此动态培养制备BC目前仍处于实验室阶段。
[0003]三角瓶虽然操作简便，易获得结果，但是具有体系小、搅拌不均匀的缺点，进一步的研究需要通过发酵罐放大进行。通用式机械搅拌发酵罐是工业化发酵生产的常用设备，其所用的搅拌桨主要分为轴向流搅拌桨和径向流搅拌桨，轴向流搅拌桨传质效率高、剪切均匀，径向流搅拌桨转速大、剪切力大。杨雪霞等研究发现，在机械搅拌罐中培养时，用剪切力大的六叶平桨进行发酵，细菌纤维素的产量最低，而用剪切力较低的框式桨进行发酵，细菌纤维素的产量较高(杨雪霞,董超,陈琳,等.剪切力对木葡糖醋杆菌及细菌纤维素合成的影响[J].纤维素科学与技术,2013,21(2).)。
[0004]BC的产率与氧转移速率和氧传递系数K
L
a成正比。氧气传递与发酵罐中使用的搅拌器的叶轮密切相关。叶轮在发酵过程中保持均匀性和气体传递方面起着至关重要的作用。传统上，六直叶涡轮(RT
‑
6)属于径向流动叶轮，特别适用于传质和气体分散，已广泛用于发酵工业。然而，RT
‑
6有一些缺点，例如输入功率较高，发酵罐中轴向搅拌混合不良，剪切力很高，很容易伤害细胞。轴向流动叶轮能够增加BC产量。值得注意的是，大多数轴向和径向流动叶轮的叶片相对于圆盘平面对称，而以垂直不对称叶片为特征的抛物线型圆盘涡轮搅拌器(BT
‑
6)可以分散比RT
‑
6叶轮多五倍的空气。

技术实现思路

[0005]针对现有发酵条件生产细菌纤维素过程中由于发酵体系中溶氧不足造成细菌纤维素产量低的问题，本专利技术提供一种了一种可行的应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，具体的是提供了一种应用不同组合的搅拌桨来提高通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，该方法通过改变发酵罐搅拌桨组合提高发酵体系K
L
a，并使细菌纤维素产量和得率显著提高。
[0006]需要明确的是本专利技术所用通用式机械搅拌发酵罐为本领域技术人员公知的通用式机械搅拌发酵罐，但是所用通用式机械搅拌发酵罐采用不同组合的搅拌桨来提高发酵体系K
L
a，并使细菌纤维素产量和得率显著提高。
[0007]本专利技术采用不同组合的搅拌桨来提高BC产量，具体组合有径向流六平叶涡轮搅拌
器和三种轴向流搅拌器组合，分别为六平叶+三斜叶，六平叶+四斜叶，六平叶+六斜叶，以及采用径向流六平叶涡轮搅拌器和非对称叶轮叶片为特征的BT
‑
6搅拌器；且本专利技术提到的不同组合的搅拌桨用于BC发酵还未见报道。
[0008]本专利技术提供了一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，汉氏驹形杆菌在利用通用式机械搅拌发酵罐动态发酵生产细菌纤维素过程中，通过采用不同组合的搅拌桨提高发酵罐K
L
a，从而提高细菌纤维素产量与得率。
[0009]本专利技术所述汉氏驹形杆菌为汉氏驹形杆菌Komagataeibacter hansenii(Man
‑
170518
‑
hww)，保藏编号为CGMCC No.15468，于2018年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0010]所述方法具体包括如下步骤：
[0011]步骤1、不同发酵罐参数下K
L
a测定
[0012]所述的测定K
L
a方法为氮气排空法，按照实验条件所需装液量装配发酵罐，控制温度在30℃，打开搅拌桨，设定为200r/min，通气量设定为1vvm，通气15min。对发酵罐溶氧电极进行校正，首先将溶氧电极放入饱和无水亚硫酸钠溶液进行零点校正，然后将溶氧电极放入发酵罐中，通气15min后进行100％溶氧校正。使用软管将氮气充入发酵罐中，观察溶氧值下降至10％以下即可停止充入氮气。向发酵罐中通入空气，待溶氧数值开始上升时，使用秒表开始计时，当溶氧升高到10％时计第一个时间点为t0，然后每隔10％记录一个时间点，直至溶氧回升到70％。记录数据，然后按照公式ln((C*
‑
C)/(C*
‑
C0))＝
‑
K
L
a(t
‑
t0)计算得到K
L
a。
[0013]所述的发酵罐包括但不限于容积为3L，10L，50L，装液量为60％的发酵罐；
[0014]所述的搅拌桨组合包括但不限于六平叶+三斜叶，六平叶+四斜叶，六平叶+六斜叶，六平叶+BT6(抛物线型圆盘涡轮搅拌器)等；优选地，为六平叶+BT6。
[0015]所述的搅拌桨组合在搅拌轴上以任意一种排列方式组合，优选为等距排列。
[0016]步骤2、发酵菌体ATP，发酵液残糖浓度及发酵液可溶性多糖含量测定
[0017]所述发酵菌体ATP测定参照BacTiter
‑
Glo
TM Microbial Cell Viability试剂盒说明书配制ATP测定酶液。取1mL发酵液，3个平行，4000r/min离心5min，去上清液，使用无菌PBS溶液清洗，4000r/min离心5min，重复3次，去上清液，使用无菌PBS重悬得到菌悬液，取100μL菌悬液和100μLATP测定酶液放入多功能酶标仪测定发光值。参照BacTiter
‑
Glo
TM Microbial Cell Viability试剂盒说明书计算ATP含量。
[0018]所述发酵液残糖浓度测定包括蔗糖含量标准曲线绘制和发酵液中蔗糖、可溶性多糖含量测定。
[0019]所述蔗糖含量标准曲线绘制为：准确称取60℃过夜烘干的蔗糖1.0g，搅拌溶于蒸馏水并定容至100mL，即得10g/L蔗糖标准溶液，根据表1添加各试剂混匀后沸水浴10min，直流水降至室温后各管加入1
‑
2滴0.1％酚酞溶液，滴加3mol/L的氢氧化钠溶液涡旋振荡至微红色，各管加入蒸馏水至10mL，涡旋混匀后取1mL加入1.5mLDNS溶液和1mL蒸馏水于干净25mL玻璃试管中，沸水浴5min，加蒸馏水定容至25mL，冷却至室温，测定各管A
540
，每组三个平行，计算蔗糖标准曲线。
[0020]所述发酵液中蔗糖含量测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种应用通用式机械搅拌发酵罐生产细菌纤维素的方法，其特征在于，汉氏驹形杆菌在利用通用式机械搅拌发酵罐动态发酵生产细菌纤维素过程中，通过采用不同组合的搅拌桨提高发酵罐K
L
a，从而提高细菌纤维素产量与得率。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：步骤1、不同发酵罐参数下K
L
a测定；步骤2、发酵菌体ATP，发酵液残糖浓度及发酵液可溶性多糖含量测定；步骤3、配制种子培养基，配方为：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，酵母蛋白胨5g/L，磷酸氢二钠2.7g/L，一水合柠檬酸1.15g/L，pH 6.0，115℃灭菌20min；步骤4、向所述步骤2配制的种子培养基中接入汉氏驹形杆菌，培养获得液体发酵菌种；步骤5、配制液体发酵培养基，配方为：蔗糖40g/L，玉米浆干粉30g/L，硫酸铵3.3g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，pH 5.0，121℃灭菌20min；步骤6、将所述步骤4获得的液体发酵菌种接入含有所述步骤5配制的液体发酵培养基的通用式机械搅拌发酵罐中，培养后结束发酵；步骤7、将发酵液匀浆漂洗，再碱煮漂洗即为细菌纤维素，烘干称重测定产量。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述汉氏...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋德明，田爱田，高红亮，黄轶敏，廖博文，邹春静，贾彩凤，常忠义，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：