可三策略检测蛋白棕榈酰化的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可三策略检测蛋白棕榈酰化的试剂盒及其应用，该试剂盒包括：50

【技术实现步骤摘要】
可三策略检测蛋白棕榈酰化的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及蛋白检测
，尤其涉及一种可三策略检测蛋白棕榈酰化的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]蛋白棕榈酰化是十六碳饱和脂肪酸通过硫酯键共价连接到蛋白半胱氨酸残基上，是重要蛋白翻译后修饰类型之一。蛋白棕榈酰化可以促进蛋白质的膜相互作用和转运，调节蛋白质之间的相互作用和酶活性，调控多个生物学过程，并参与癌症等多种疾病发生发展，其重要性正在被研究认识。随着蛋白棕榈酰化研究深入，其研究越来越广泛。蛋白棕榈酰化修饰(protein palmitoylation)，指16碳饱和脂肪酸即棕榈酸通过共价连接蛋白质半胱氨酸残基，属于蛋白质翻译后修饰范畴。棕榈酰化对蛋白质功能有极其重要的影响：可提高蛋白质疏水性，调节蛋白质活性和稳定性，介导膜融合和胞内转运定位；影响膜蛋白构象，有助于蛋白膜连接；参与调节多种细胞信号通路，介导蛋白质
‑
蛋白质、蛋白质
‑
脂质以及与其他翻译后修饰的相互作用；棕榈酰化蛋白质还参与细胞膜脂质结构域，促进自身或其他蛋白质定位于脂筏；参与肿瘤发生发展，与前列腺癌、结肠癌、胃淋巴癌、乳腺癌、白血病等多种癌症阿尔茨海默病、亨廷顿病、精神分裂症、X
‑
性联精神发育迟缓等疾病相关。
[0003]蛋白质棕榈酰化检测方法有放射性棕榈酸盐代谢标记法、叠氮或炔基棕榈酸类似物代谢标记、质谱分析法、酰基生物素交换法(ABE)。
[0004]不同方法各具特点：放射性棕榈酸盐代谢标记法，需要处理对环境有害的放射性同位素，且只能检测活细胞中的发生棕榈酰代谢的蛋白质。叠氮或炔基棕榈酸类似物代谢标记，不能分析组织样品和体液样品，同时引入棕榈酸类似物可能对细胞生物学有潜在影响。质谱分析法需要价格高昂的质谱仪和纯化程度高的样品。酰基
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生物素交换法是一种常见的检测蛋白质翻译后修饰的方法。蛋白质的半胱氨酸残基上的巯基基团，由于其高反应性，很容易发生各种氧化还原反应或酰化反应。酰基
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生物素交换法的实质是将所要检测的翻译后修饰转化为酰基化的生物素基团。酰基
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生物素交换法(ABE)则不具以上缺点，使用比较广泛，但此法涉及试剂多，配制过程中需用天平、pH计、涡旋震荡等仪器，配制繁琐费时。在检测蛋白棕榈酰化检测实验前通常需要摸索优化试剂浓度，耗费精力和时间，增加实验成本。因此需要一种能便捷易用的试剂盒以减少时间和劳动力成本并提高效率。
[0005]公开号为CN113358634A的中国专利文献公开了一种棕榈酰化修饰蛋白的检测试剂盒及其使用方法，该方法引入离心管柱的使用，结合两种实验方法，针对不同的样品处理需求，都能很好的减少样品损失，缩短样品处理时间。但是该专利技术申请并未公开离心管柱的具体性质，截留物质分子大小均未提供，可能无法达到预期效果。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种可三策略检测蛋白棕榈酰化的试剂盒，可应用于检测三种策略得到的蛋白的棕榈酰化，包括样本总蛋白的棕榈酰化、免疫沉淀的特异靶蛋白的棕榈酰化、
生物素
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亲和素沉淀的靶蛋白的棕榈酰化，以解决蛋白棕榈酰化检测不够便捷、效率低下的技术问题。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种可三策略检测蛋白棕榈酰化的试剂盒，包括：
[0009]50
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100mmol/L的NEM(N
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乙基顺丁烯二酰亚胺)试剂，1
‑
1.5mol/L的HAM(羟胺)试剂，0.1
‑
1μmol/L的BMCC
‑
Biotin(1
‑
生物素酰氨基
‑4‑
[4
’‑
(甲基马来酰胺)环己烷甲酰胺]丁烷)试剂，蛋白沉淀试剂，过氧化物酶标记的链霉亲和素，缓冲液。
[0010]本专利技术的试剂盒可结合SDS
‑
PAGE和电转印可检测蛋白棕榈酰化。
[0011]优选的，所述的NEM试剂包括N
‑
乙基顺丁烯二酰亚胺固体试剂及与其匹配的NEM试剂B；N
‑
乙基顺丁烯二酰亚胺固体试剂与缓冲液配制成50
‑
100mmol/L的N
‑
乙基顺丁烯二酰亚胺溶液；
[0012]所述的NEM试剂B包含20mM的Tris、150mM的NaCl，1％(v/v)的Triton X
‑
10，溶剂为水，pH为7.5。
[0013]NEM试剂B的配制：根据欲配制的体积和浓度称取Tris、NaCl、Triton X
‑
100，混合并加入蒸馏水约4/5体积，充分搅拌溶解后，加入浓盐酸调pH至7.5，最后定容到100％体积。
[0014]优选的，所述的HAM试剂包括羟胺固体试剂及与其匹配的缓冲液；羟胺固体试剂与缓冲液配制成1
‑
1.5mol/L的羟胺溶液；
[0015]与羟胺固体试剂匹配的缓冲液为pH为7.2的Tris
‑
HCL缓冲液。
[0016]优选的，所述的BMCC
‑
Biotin试剂包括BMCC
‑
Biotin固体试剂、溶剂及Tris
‑
HCL缓冲液；BMCC
‑
Biotin固体试剂与溶剂配制贮存液；BMCC
‑
Biotin固体试剂或贮存液与Tris
‑
HCL缓冲液配制0.1
‑
1μmol/L的BMCC
‑
Biotin溶液。
[0017]优选的，所述的蛋白沉淀试剂为丙酮或乙醇。
[0018]优选的，所述的过氧化物酶标记的链霉亲和素为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素溶液，浓度为1mg/ml。
[0019]本专利技术的试剂盒可应用于检测样本的总蛋白、免疫沉淀的特异靶蛋白、或生物素
‑
亲和素沉淀的仅发生棕榈酰化的靶蛋白等的棕榈酰化，使用范围更加广泛，可针对不同实验目的使用更加灵活。
[0020]本专利技术提供了采用所述试剂盒检测样本的试剂沉淀总蛋白棕榈酰化的方法，包括以下步骤：
[0021](1)采用所述试剂盒中的试剂配制NEM试剂、HAM试剂盒BMCC
‑
Biotin试剂；
[0022](2)将待测细胞样本加入配制的NEM试剂中进行裂解，之后加入蛋白沉淀试剂，离心后去除上清液留下沉淀；
[0023](3)在步骤(2)的沉淀中加入HAM试剂进行反应，之后加入蛋白沉淀试剂，离心后去除上清液留下沉淀；
[0024](4)在步骤(3)的沉淀中加入BMCC
‑
Biotin试剂，4℃下进行孵育反应，之后加入蛋白沉淀试剂，离心后去除上清液留下沉淀；
[0025](5)在步骤(4)的沉淀中加入NEM试剂B，进行蛋白定量，之后加入缓冲液混本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可三策略检测蛋白棕榈酰化的试剂盒，其特征在于，包括：50
‑
100 mmol/L 的NEM试剂，1
‑
1.5 mol/L的HAM试剂，0.1
‑
1μmol/L 的BMCC
‑
Biotin试剂，蛋白沉淀试剂，过氧化物酶标记的链霉亲和素，缓冲液。2.根据权利要求1所述的可三策略检测蛋白棕榈酰化的试剂盒，其特征在于，所述的NEM试剂包括N
‑
乙基顺丁烯二酰亚胺固体试剂及与其匹配的NEM试剂B；N
‑
乙基顺丁烯二酰亚胺固体试剂与缓冲液配制成50
‑
100 mmol/L 的N
‑
乙基顺丁烯二酰亚胺溶液；所述的NEM试剂B包含20mM的Tris、150mM的NaCl，1%（v/v）的Triton X
‑
10，溶剂为水，pH为7.5。3.根据权利要求1所述的可三策略检测蛋白棕榈酰化的试剂盒，其特征在于，所述的HAM试剂包括羟胺固体试剂及与其匹配的缓冲液；羟胺固体试剂与缓冲液配制成1
‑
1.5 mol/L的羟胺溶液；与羟胺固体试剂匹配的缓冲液为pH为7.2的Tris
‑
HCL缓冲液。4.根据权利要求1所述的可三策略检测蛋白棕榈酰化的试剂盒，其特征在于，所述的BMCC
‑
Biotin试剂包括BMCC
‑
Biotin固体试剂、溶剂及Tris
‑
HCL缓冲液；BMCC
‑
Biotin固体试剂与溶剂配制贮存液；BMCC
‑
Biotin固体试剂或贮存液与Tris
‑
HCL缓冲液配制0.1
‑
1μmol/L 的BMCC
‑
Biotin溶液。5.根据权利要求1所述的可三策略检测蛋白棕榈酰化的试剂盒，其特征在于，所述的蛋白沉淀试剂为丙酮或乙醇。6.根据权利要求1所述的可三策略检测蛋白棕榈酰化的试剂盒，其特征在于，所述的过氧化物酶标记的链霉亲和素为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素溶液，浓度为1mg/ml。7.一种采用如权利要求1
‑
6任一项所述试剂盒检测样本的试剂沉淀总蛋白棕榈酰化的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）采用所述试剂盒中的试剂配制NEM试剂、HAM试剂盒BMCC
‑
Biotin试剂；（2）将待测细胞样本加入配制的NEM试剂进行裂解，之后加入蛋白沉淀试剂，离心后去除上清液留下沉淀；（3）在步骤（2）的沉淀中加入HAM试剂进行反应，之后加入蛋白沉淀试剂，离心后去除上清液留下沉淀；（4）在步骤（3）的沉淀中加入BMCC
‑
Biotin试...

【专利技术属性】
技术研发人员：李坤，易晨晨，孙培蓓，程小红，
申请(专利权)人：杭州医学院，
类型：发明
国别省市：