分离的双加氧酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种分离的酶，为一种α

【技术实现步骤摘要】
分离的双加氧酶及其编码基因与应用


[0001]本专利技术涉及一种分离的α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶Tw2ODD5及其编码基因，可催化对映
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贝壳杉烯酸C
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2位羟化，属于药用植物基因工程领域。

技术介绍

[0002]雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是传统中药雷公藤的植物来源，具有清热解毒，祛风除湿，杀虫止痒，消肿散结等功效(高伟,刘梦婷,程琪庆,等.雷公藤的本草考证[J].世界中医药,2012,7(6):560
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562.)。现代研究表明雷公藤可用于风湿性关节炎,肾小球肾炎,肾病综合征等病的治疗。萜类成分是雷公藤的主要活性成分，贝壳杉烷型二萜是其中的重要组成部分。从中药的活性成分中开发新药是一种很有前景的方式，然而由于植物的生长缓慢且药用成分含量很低，大大限制了其应用。近年来利用合成生物学技术设计和改造微生物菌株来生产天然活性产物已经成为一种极具潜力的获取方法。
[0003]萜类化合物在高等植物中的合成途径主要有两种，位于细胞质中的MVA途径和位于质体中MEP途径,通过以上两个途径生成萜类的共同前体异戊烯基焦磷酸(IPP)及其同分异构体二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)；在异戊烯转移酶的催化下，生成GGPP前体，再由二萜合酶(Diterpene synthase)催化形成二萜烯中间体母核结构(Su P.*,Gao L.H.*,Liu S.,et al.Probing the function of protein farnesyltransferase in Tripterygium wilfordii[J].Plant Cell Reports,2019,38(2):211
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220)，然后母核在氧化酶、甲基转移酶等后修饰酶的作用下生成复杂多样的二萜类活性化合物。
[0004]α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶(2
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oxoglutarate/Fe(II)
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dependent dioxygenases,2
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ODDs),是一类不含血红素的单核铁原子蛋白，与细胞色素P450单加氧酶相比，2
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ODDs反应时仅需要2个或者3个配体，因此具有更高的灵活性，其所催化的反应更具多样性和复杂性(Farrow和Facchini2014)。2
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ODDs是一个庞大的基因家族,一般根据其氨基酸序列BLAST P值分为3个具有明显差异的亚家族，分别是DOXA、DOXB和DOXC(Kawai等2014)，其中DOXA和DOXB调控植物关键的生长发育过程,如初生代谢、多肽链的翻译后修饰等，在数量和蛋白序列上具有较高的保守性。DOXC亚家族参与植物的次生代谢,包括酚酸类,生物碱类以及萜类成分等,它在不同植物体内数量和功能差异较大,具有较大的物种间特异性(Kawai等2014)。这三类2
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ODDs在植物界中广泛存在,可以催化羟基化反应、去甲基化反应、开环反应、去饱和反应、闭(成)环反应和卤化反应等(Islam等2018)。
[0005]张逸风等人成功鉴定了雷公藤中的首个α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶TwGA13ox,，体外酶促研究证实其可以催化赤霉素A9的C13位发生氧化，生成赤霉素A20。本专利技术从雷公藤悬浮细胞中克隆得到一条α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶基因Tw2ODD5。通过体外酶促反应验证其皆具有催化对映
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贝壳杉烯酸(ent
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kauranoic acid，缩写KA)的C2位发生氧化生成相应羟化产物的功能。该基因是从雷公藤中首次克隆得到的，在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的雷公藤2ODD酶基因及其氨基酸序列。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一方面，提供了一种分离的酶，所述酶参与二萜类化合物的生物合成，尤其是贝壳杉烷型二萜类化合物，如2
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羟基对映贝壳杉烯酸。
[0007]本专利技术中，所述分离的酶，是一种双加氧化镁，尤其是一种α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶(以下可用Tw2ODD5表示)，为一种参与贝壳杉烷型二萜类化合物的生物合成，尤其是2
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羟基对映贝壳杉烯酸合成的关键酶，所述酶具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸其功能相同的肽。
[0008]可以在Tw2ODD5酶中进行氨基酸序列改变以便最少破坏对生物学活性必须的高级结构。例如，当Tw2ODD5酶包含一个或多个螺旋时，将改变氨基酸残基以便不破坏螺旋的几何学和其中的构象改变将使一些关键功能(例如分子与其结合伙伴的结合)减弱的其它分子成分。氨基酸序列改变的效果可以通过例如以上公开的计算机模拟进行预测，或通过晶体结构分析进行测定(见例如Lapthorn等，Nat.Struct.Biol.2:266
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268，1995)。本领域熟知的其它技术对改变蛋白和标准分子(例如天然蛋白)的折叠进行比较，例如，可以比较变体和标准分子中的半胱氨酸分布情况。质谱和使用还原和烷基化的化学修饰为测定与二硫键相关的或未形成这些键的半胱氨酸残基提供了方法(Bean等，Anal.Biochem.201:216
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266,1992；Gray，Protein Sci.2:1732
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1748,1993；和Patterson等，Anal.Chem.66:3727
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3732，1994)。一般认为如果修饰的分子与标准分子具有不相同的半胱氨酸分布情况，则折叠受到影响。另一个用于测量这点的被接受的熟知方法是园二色谱(CD)。测量和比较修饰分子和标准分子产生的CD谱是常规的(Johnson,Proteins 7:205
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214,1990)。晶体学是另一个分析折叠和结构的熟知方法，核磁共振(NMR)、消化肽作图和表位作图也是分析折叠及蛋白质和多肽之间的结构相似性的已知方法(Schaanan等，Science 257:961
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964,1992)。
[0009]本专利技术中，Tw2ODD5酶的变异体形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与Tw2ODD5酶编码基因杂交的DNA所编码的蛋白。
[0010]本专利技术的第二方面，提供了一种编码本专利技术所述酶的多核苷酸(或称α
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酮戊二酸依赖型双加氧酶编码基因，以下可用Tw2ODD5表示)，所述多核苷酸优选具有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列及其简并序列。该简并序列指位于SEQ ID NO：1序列核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分离的酶，所述酶具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述酶的多核苷酸。3.权利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。4.包含权利要求2或3所述多核苷酸的表达载体。5.包含权利要求2或3所述多核苷酸、或权利要求4所述表达载体的重组宿主菌。6.权利要求5所述的重组宿主菌，所述宿主菌为大肠杆菌。7.权利要求1所述酶、或权利要求2或3所述多核苷酸、或权利要求4所述表达载体、或权利要求5或6所述重组宿主菌在调节和/或合成贝壳杉烷型二萜类化合物中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：高伟，王家典，吴晓毅，王荣凤，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：