一种真菌漆酶、其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种真菌漆酶，其制备方法及应用。真菌漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还公开了编码该真菌漆酶的基因如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还构建了该真菌漆酶的重组表达菌株CGMCC No.24040，其表达的真菌漆酶的酶活力比现有的野生型漆酶LAC1的酶活力提高了59％，获得的真菌漆酶对多种金属离子和EDTA的耐受性都有不同程度的提高。EDTA的耐受性都有不同程度的提高。EDTA的耐受性都有不同程度的提高。

【技术实现步骤摘要】
一种真菌漆酶、其制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种真菌漆酶、其制备方法及应用，属于生物


技术介绍

[0002]漆酶是一种含有铜离子的多酚氧化酶，由500
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550个氨基酸组成，活性部分含有4个铜离子。漆酶可降解底物广泛，包括木质素、偶氮染料、氯酚类化合物和多环芳烃类等，因此，在多种方面具有重要应用前景。偶氮染料是染料生产中使用最多的一类，偶氮染料的处理主要有吸附法、混凝沉降法、电化学法等，这些传统的处理方法能耗高，降解效率低，且容易造成二次污染。近年来，用微生物/酶处理法逐渐受到重视。其中，漆酶可以有效降解偶氮染料，可以用于牛仔布浮石洗涤过程中，也可以用于后期的靛蓝降解过程中。在造纸工业中，传统纸浆漂白多用含氯的化学试剂，对环境破坏严重。目前有人用漆酶
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介体体系在纸浆漂白上取得了很好的效果，具有很好的应用前景。漆酶已经广泛应用于食品工业。葡萄酒、啤酒和果汁等饮料在长期存贮过程中会使多酚类物质氧化，饮品验收会变深，甚至出现浑浊，口感也会发生改变。在饮品中加入漆酶，会减少这种现象的发生。
[0003]漆酶在自然界分布广泛，动物、植物、微生物等均有发现。真菌漆酶由于其高催化活性和稳定性，应用范围广，受到广泛重视。野生型漆酶生产菌种所产生的漆酶活力往往比较低、生产不稳定，因此需要用基因工程手段进行改造。
[0004]本专利技术通过基因工程技术，克隆了一种新型漆酶编码基因，实现了其在毕赤酵母中的高效分泌表达，并通过定点突变技术，提高了酶的发酵活力和金属离子的耐受性。

技术实现思路

[0005](一)要解决的技术问题
[0006]为了解决现有技术的上述问题，本专利技术提供一种真菌漆酶、其制备方法及应用。
[0007](二)技术方案
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：
[0009]一种真菌漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]编码如上所述真菌漆酶的基因，所述基因对应编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列。进一步地，其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]本专利技术的提供真菌漆酶，其催化温度适中，在45
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50℃均有较高的催化能力，pH范围广，从pH2.0
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8.0都具有催化活性，能够耐受多种金属离子；如以ABTS为底物时，酶活为可达1600U/mL；最适pH值为pH5.0.最适催化温度为50℃。
[0012]一种含如上所述真菌漆酶基因的重组载体或重组菌株。
[0013]将如上所述真菌漆酶基因的重组载体，优选地，采用毕赤酵母表达载体进行构建重组载体。
[0014]将如上所述真菌漆酶基因的重组菌株，优选地，重组菌株转入的表达载体为含有序列如SEQ ID NO.2的毕赤酵母表达载体，宿主细胞为毕赤酵母X
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33。
[0015]如上所述重组载体的构建方法，其包括如下步骤：
[0016]S1、PCR扩增：对含SEQ ID NO.5所示的基因或质粒，用引物M1如SEQ ID NO.9所示序列和R
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x如SEQ ID NO.8所示序列进行PCR扩增，获得950bp的D1片段；利用引物SEQ ID NO.10和F
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e如SEQ ID NO.7所示序列进行PCR扩增，获得1100bp的D2片段；
[0017]S2、突变：将获得的D1片段和D2片段，用于物F
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e如SEQ ID NO.7所示序列和R
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x如SEQ ID NO.8所示序列进行扩展性扩增；扩增产物获得含有两个氨基酸突变的漆酶基因；
[0018]S3、对步骤S2获得的PCR产物用EcoRI/XbaI双酶切；
[0019]S4、毕赤酵母表达载体双酶切：将pPICZaA质粒用EcoRI酶和XbaI酶进行酶切；获得经过EcoRI/XbaI双酶切的pPICZaA质粒；
[0020]S5、重组载体的构建：将步骤S4经过EcoRI/XbaI双酶切的pPICZaA质粒和步骤S3的酶切产物，在T4 DNA连接酶的作用下获得重组载体，测序正确即获得重组表达载体。
[0021]如上所述真菌漆酶的重组载体的制备方法，获得的重组载体含有受甲醇严格调控的醇氧化酶启动子AOX1，能够以甲醇为唯一碳源生长，并高效率表达漆酶；此外，在漆酶基因上游含有酿酒酵母α
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信号肽序列，可以使表达的漆酶分泌到细胞外。
[0022]如上所述重组载体的构建方法，将上述构建的重组表达载体转入大肠杆菌Top10感受态细胞中，培养，之后取单菌落划线培养，对pPIC
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lac1进行序列测定，分析序列连接正确，说明成功构建重组载体。
[0023]一种真菌漆酶的表达重组菌株的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
[0024](1)将含有如上所述的重组载体用限制性内切酶SacI线性化；
[0025](2)毕赤酵母X
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33感受态细胞的制备；
[0026](3)将步骤(1)线性化后的重组载体与步骤(2)获得的毕赤酵母X
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33感受态细胞进行电击转化，之后涂布YPDS平板进行培养；
[0027](4)重组菌株的PCR扩增、鉴定，含有SEQ ID NO.2所示序列说明重组菌株构建成功。
[0028]优选地，在步骤(4)中，所述PCR扩增时所用的引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
[0029]一种用于表达如权利要求1所述真菌漆酶的菌株，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.24040。
[0030]如上所述的真菌漆酶或由CGMCC No.24040菌株表达获得的真菌漆酶在食品加工、纸浆漂白、染料脱色中的应用。
[0031](三)有益效果
[0032]本专利技术的有益效果是：
[0033]本专利技术提供了一种真菌漆酶以及其重组表达菌株，重组表达菌株在摇瓶中发酵活力达到1600U/mL，比现有的野生型酶LAC1的酶活力提高了59％，获得的真菌漆酶对多种金属离子和EDTA的耐受性都有不同程度的提高；发酵活力高于现有报道。
[0034]本专利技术提供的重组表达菌株CGMCC No.24040，经过大量培养即可获得高酶活力和能够耐受多种金属离子的真菌漆酶，制备方法简单，产量高，能有效降低生产成本。
[0035]本专利技术制备获得的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的真菌漆酶可广泛用于食品加工、纸浆漂白、染料脱色中的应用。
附图说明
[0036]图1为发酵上清液的酶蛋白SDS
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PAGE电泳图；其中，M：蛋白分子量对照；1：LAC1表达产物；2：LACST表达产物；
[0037]图2为重组漆酶LAC1和LACST在不同pH条件下的相对催化活性；
[0038]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种真菌漆酶，其特征在于，所述真菌漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述真菌漆酶的基因，其特征在于，所述基因对应编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.含有权利要求2所述的真菌漆酶基因的重组载体或重组菌株。4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的表达载体为毕赤酵母表达载体。5.如权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，重组菌株转入的表达载体为含有序列如SEQ ID NO.2的毕赤酵母表达载体，宿主细胞为毕赤酵母X
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33。6.一种真菌漆酶的重组载体的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1、PCR扩增：对含SEQ ID NO.5所示的基因或质粒，用引物M1如SEQ ID NO.9所示序列和R
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x如SEQ ID NO.8所示序列进行PCR扩增，获得950bp的D1片段；利用引物SEQ ID NO.10和F
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e如SEQ ID NO.7所示序列进行PCR扩增，获得1100bp的D2片段；S2、突变：将获得的D1片段和D2片段，用于物F
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e如SEQ ID NO.7所示序列和R
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x如SEQ ID NO.8所示序列进行扩展性扩增；获得含量两个氨基酸突变的漆酶基因。S3、对步骤S2获得的PCR产物用EcoRI...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋娟，李国高，李琦，
申请(专利权)人：湖南利尔康生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：