具有除草剂抗性的HPPD突变型蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了突变型HPPD蛋白、编码所述蛋白的或片段的核酸或基因，其中所述HPPD蛋白或其生物活性片段保留或加强了其催化对羟基苯丙酮酸(4

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有除草剂抗性的HPPD突变型蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于植物蛋白和植物抗除草剂领域，涉及具有除草剂抗性的HPPD突变型基因、蛋白及其应用；具体而言，本专利技术涉及水稻的对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)突变基因及其编码的突变HPPD蛋白，该突变蛋白能赋予植物尤其水稻抗对羟基苯丙酮酸双加氧酶抑制剂类除草剂的特性。本专利技术公开了该突变蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列，以及它们在植物抗除草剂领域中的应用。

技术介绍

[0002]农田杂草与作物竞争生存空间、光照、水分和养分等资源，并可能成为病虫害的中间寄主，严重干扰作物生长，引起减产。传统的人工拔草费工费时，效率低；机械除草通常不彻底，过度以及不合理地翻耕还容易造成土壤侵蚀、养分流失、能源过度消耗、温室气体排放等问题。喷施除草剂除草简便易行、效果好、效率高，逐渐成为了农田防控杂草最经济有效的手段。然而，单一作用靶标的除草剂多年连续使用，使多种杂草产生了严重的抗药性，成为恶性杂草。此外，如磺酰脲类等除草剂在土壤中残效期长，对下茬作物影响较大，也可能随水渗透，造成污染环境。
[0003]20世纪90年代对羟基苯丙酮酸双加氧酶(4
‑
hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPPD)首次被确定为除草剂作用靶标，此后一系列HPPD抑制剂类除草剂相继被开发出来，包括异噁唑类、二酮腈类、三酮类、吡唑盐类等。HPPD是质体琨和生育酚合成途径中的关键酶。质体琨是类胡萝卜素合成途经中的关键酶八氢蕃茄红素脱氢酶(phytoene desaturase)反应的电子受体，也是光合系统II的电子受体。质体琨和生育酚都是重要的抗氧化物质，能够清除植物组织中的活性氧自由基。抑制HPPD的活性，将造成质体琨和生育酚的缺乏，影响类胡萝卜素的合成和光合作用，从而导致植物白化死亡。HPPD抑制剂类除草剂可以作为ALS抑制剂类、酰胺类、合成激素类等除草剂的轮换药剂和复配药剂，防治农田恶性杂草。HPPD抑制剂类除草剂一般具有高效低毒、不易产生抗性、环境兼容性好、对后茬作物安全等优点。
[0004]植物抗除草剂主要依靠靶标抗性和非靶标抗性两种机制。靶标抗性是指除草剂的靶标基因或其编码蛋白发生变化，导致植物能够抵抗或耐受一定浓度的除草剂。最常见的靶标抗性的形式是除草剂靶标基因的编码序列发生改变，导致靶标蛋白的某个或某些氨基酸发生突变，使得除草剂不能结合靶标蛋白，而该蛋白的正常生理功能却不受影响。例如，将玉米HPPD酶的编码基因与对HPPD抑制剂类除草剂具有抗性或耐受性的细菌的HPPD编码基因进行基因改组(DNA family Shuffling)，获得具有18个点突变的突变型玉米HPPD基因，在大豆中过量表达该突变型玉米HPPD蛋白，使大豆产生了对多种三酮类除草剂的抗性(Siehl et al,2014)。DNA shuffling的方法造成多个位点的突变，可能改变了HPPD的整体构象；又如，将多种植物的HPPD蛋白序列与对HPPD抑制剂类除草剂具有抗性或耐受性的细菌的HPPD蛋白进行序列比对，进而对植物HPPD编码基因进行单点和多点突变，将突变的植物HPPD蛋白转入相应的植物中，能够赋予转基因植物对于HPPD抑制剂类除草的抗性或耐受
性；另有研究报道，直接将荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)的HPPD基因转入到大豆和烟草的叶绿体中也能够提高植物对于硝磺草酮的抗性(Dufourmantel et al.,2009)。此外，除草剂的靶标蛋白序列没有改变，但是提高植物体内除草剂的靶标基因的拷贝数或表达水平，产生过量的野生型HPPD蛋白，也能使植物耐受一定水平的HPPD抑制剂类除草剂。
[0005]非靶标抗性是指靶标蛋白序列、基因拷贝数和表达水平没有改变，而由于植物对除草剂的吸收少，转移慢；或者进入体内的除草剂被降解、修饰或钝化，使除草剂不能抑制靶标蛋白的活性。目前，对HPPD抑制剂类除草剂非靶标抗性的研究主要集中在玉米和杂草中。一类目前应用较广的HPPD抑制剂类除草剂硝磺草酮主要是应用于玉米田的除草剂，玉米对于硝磺草酮具有耐受性，苗前苗后均可承受一定浓度的硝磺草酮，而玉米的正常生长不受显著性的影响。已有研究报道相比于对硝磺草酮敏感的植物，玉米对硝磺草酮的吸收相对较慢，代谢相对较快(Mitchell et al.,2001)。另有研究鉴定到对了硝磺草酮不敏感的杂草糙果苋群体(Hausman et al.,2011；Ma et al.,2013)，和敏感群体相比，抗性群体的硝磺草酮吸收速率与敏感群体没有明显差异，甚至略高于敏感群体，然而半降解时间(DT50)显著短于敏感群体，除草剂处理离体叶片结合高效液相色谱鉴定结果表明，在喷施硝磺草酮24小时之后，抗性群体中的硝磺草酮的含量显著低于敏感群体(Ma et al.,2013)。在糙果苋中施加马拉硫磷或四环唑(Tetcyclacis)之后，硝磺草酮不敏感的群体对硝磺草酮的敏感性变高，说明硝磺草酮不敏感的糙果苋可能对除草剂的代谢能力更强(Ma et al.,2013)。
[0006]为创制除草剂抗性或耐受性作物品种，转基因技术已经广泛采用。然而，转基因作物品种的安全性在全球范围内仍存在较大争议，各国对于转基因作物的商品化也持有不同的态度。目前，受到政策影响和转基因作物登记成本的限制，转基因抗除草剂的应用和推广具有较大阻力。新近发展起来的以CRISPR系统为代表的基因编辑技术有望改善上述困境。通过CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1等系统介导的基因定点突变及同源重组可以对植物内源除草剂靶标基因进行改造，从而赋予植物对于除草剂的抗性或耐受性。目前报道的成功实例都集中在乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂类、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂类和草甘膦等除草剂的抗性和耐受性植物的创制方面。考虑到HPPD抑制剂类除草剂的巨大应用前景，以及非转基因HPPD抑制剂类除草剂抗性和耐受性植物种质的缺乏，需要科学家不断研究提高作物对这一类除草剂抗性和耐受性的方法。水稻是全球最重要的粮食作物，而其野生型品种对于绝大多数的HPPD抑制剂类除草剂敏感。
[0007]此前，尚未有文献报道对水稻内源HPPD编码基因进行单点或多点突变能够同时赋予水稻多种HPPD抑制剂类除草剂的抗性。

技术实现思路

[0008]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物对除草剂抗性的突变型蛋白。进一步地，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗(耐)对羟基苯丙酮酸双加氧酶抑制剂类除草剂特性的水稻HPPD突变型蛋白。
[0009]本专利技术还要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗除草剂特性的突变型基因。进一步地，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗(耐)对羟基苯丙酮
酸双加氧酶抑制剂类除草剂特性的水稻HPPD突变型基因。
[0010]本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种表达盒、重组载体或细胞。
[0011]本专利技术还要解决的技术问题是提供了水稻HPPD突变型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种水稻HPPD突变型蛋白，其特征在于，所述水稻HPPD突变型蛋白的氨基酸序列存在以下任意一种或多种突变：其对应于野生型水稻HPPD的氨基酸序列的第29、52、54、68、92、99、117、120、132、133、146、156、206、216、237、238、244、266、270、273、277、282、295、297、310、313、315、316、325、333、336、338、344、345、346、349、357、388、392、404、406、408、415和423位氨基酸发生突变；其中，第277位由脯氨酸突变为缬氨酸，第336由脯氨酸突变为丝氨酸，第338位由天冬氨酸突变为赖氨酸或异亮氨酸或苏氨酸，第346位由精氨酸突变为亮氨酸，第392位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸，第415位由甘氨酸突变为丙氨酸或天冬酰胺或丝氨酸。2.根据权利要求1所述的水稻HPPD突变型蛋白，其特征在于，所述水稻HPPD突变型蛋白的氨基酸序列对应于野生型水稻HPPD的氨基酸序列，具有选自下述的一种或多种突变形式：V29A、V52I、L54F、F68S、L92I、P99L、T117I、S120A、F132S、A133T、R146L、A156V、E206Q、E206V、Y216C、Y237N、I238T、F244L、V266A、N270D、T273S、V282E、L295Q、H297R、S310C、S310V、S310A、S310G、S310T、V313M、V313I、V313L、G315A、G315S、G315R、T316K、A325D、A333P、R344K、R345L、R345Q、D349G、N357S、F388L、S404G、S404L、S404T、Q406R、Y408H和E423G。3.根据权利要求1或2所述的水稻HPPD突变型蛋白，其特征在于，其包括：(a)其氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:122；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有对羟基苯丙酮酸双加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白质。4.根据权利要求1～3中任一项所述的水稻HPPD突变型蛋白，其特征在于，所述突变型HPPD蛋白的氨基酸序列具有如下的氨基酸突变中的任意一种：R345Q/R346L、Y216C/R345Q、P336S/R346L、V29A/R346L、L295Q/S310V、V29A/S310C、S310C/G415A、S310C/G415N、L295Q/R345Q、L295Q/S310C、L54F/R345Q、L54F/R346L、S120A/S310C、F68S/S310C、V266A/S310C、V266A/R345Q、S310C/M392I、S310C/R345Q、T273S/S310C、L92I/M392I、S310C/V313I、Y216C/P277V/R345Q、Y216C/P336S/R345Q、Y216C/R345Q/R34...

【专利技术属性】
技术研发人员：张保龙，杨郁文，周珍珍，刘廷利，郭冬姝，
申请(专利权)人：江苏中旗作物保护科技有限公司，
类型：发明
国别省市：