一种检测革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子及其制备方法，属于分析化学领域，涉及革兰氏阴性菌的分析检测和分子印迹聚合物的合成。所述分子印迹荧光纳米粒子能够特异性识别革兰氏阴性菌比如大肠杆菌O157:H7和荧光假单胞菌，并能够通过荧光信号变化进行细菌的定量分析。所述合成方法包括以下步骤：首先将模板菌液与功能单体和荧光单体预组装，然后依次加入交联剂、引发剂进行聚合反应；反应完毕后，将聚合的纳米粒子从模板上去除，即得该菌的分子印迹荧光纳米粒子。本发明专利技术采用一锅法搅拌的方式制备革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子，操作简单，所得分子印迹荧光纳米粒子能够特异性快速识别革兰氏阴性菌。纳米粒子能够特异性快速识别革兰氏阴性菌。纳米粒子能够特异性快速识别革兰氏阴性菌。

【技术实现步骤摘要】
一种检测革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子及其制备方法
[0001]

[0002]本专利技术属于分析化学领域，涉及革兰氏阴性菌的检测分析和分子印迹聚合物的合成，具体涉及一种检测革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子及其制备方法。
[0003]
技术介绍

[0004]革兰氏阴性菌是指在利用革兰氏染色法进行细菌鉴别时，不能被结晶紫染色的细菌，比如大肠杆菌和荧光假单胞菌；而能够被结晶紫染色的细菌，被称为革兰氏阳性菌，比如金黄色葡萄球菌。革兰氏阴性菌的细胞壁中有一层薄的肽聚糖，细胞膜表面分布有大量的脂多糖，以及糖蛋白等糖类缀合物，而革兰氏阳性菌表面的糖类缀合物分布较少。革兰氏阴性菌是一大类病原体，可感染从植物到哺乳动物的所有真核生物[Current Opinion in Immunology,38(2016) 8
‑
17]，其主要病原能力在于外膜上的脂多糖，又被称为内毒素。人体被革兰氏阴性菌感染后，细菌表面的内毒素能够和免疫系统反应，引起功能紊乱，导致食源性疾病。因此，发展快速、灵敏的检测革兰氏阴性菌的方法，在临床诊断及食品安全领域具有重要的意义和价值。目前，革兰氏阴性菌的检测分析方法主要包括菌落计数法、聚合酶链式反应（PCR）和酶联免疫分析（ELISA）等，这些方法虽然具有高灵敏度和准确性，但是存在操作复杂、费时费力、分析成本高等缺点。基于分子印迹荧光纳米粒子的荧光检测分析方法能够克服以上方法的缺点，用于目标物的特异性快速分析，操作简单，分析成本低 [RSC Adv., 11(2021)7732
‑/>7737; Sci. Rep., 10 (2020) 9924]。
[0005]分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymer, MIP），是一种具有特殊分子识别能力的高分子聚合物，其选择性识别能力的形成原理是：先将模板分子与功能单体通过共价键或非共价作用形成复合物，随后加入交联剂和引发剂获得分子印迹预聚液；然后，引发聚合反应获得含有模板分子的高分子聚合物；最后，移除聚合物中的模板分子，从而在聚合物中会留下与模板分子形状互补的印迹空腔，该空腔中还保留有功能单体的作用官能团，因此该印迹空腔对模板分子具有选择性识别能力。由于分子印迹聚合物制备简单、成本低、稳定性高、使用寿命长、可大规模生产，在分离科学、生物传感、药物递送、模拟酶催化等领域已经展现出重要的应用价值 [Chem. Soc. Rev., 45 (2016) 2137
‑
2211]。尤其是分子印迹荧光纳米粒子，不仅在荧光成像分析方面表现出强大的优势，而且在疾病诊断治疗上展现出极大的潜力和前景[Chem. Rev., 120 (2020) 9554
–
9582; Angew. Chem. Int. Ed., 60 (2021) 3858
–
3869]。以微生物为研究目标设计合成分子印迹聚合物，所用模板分子主要是蛋白质或肽段，但是这些模板分子纯化困难，难以获得纯度高的模板分子，极大限制了该类分子印迹聚合物的研究；另外，以这些蛋白质或肽段为模板分子所制备的分子印迹聚合物选择性和特异性不高，导致微生物分子印迹聚合物在食品安全和医疗诊断领域的
相关研究不足[Chem. Soc. Rev., 47 (2018) 5574
‑
5587]。
[0006]
技术实现思路

[0007]以微生物为研究目标设计合成分子印迹聚合物，常用微生物表面的蛋白质、肽段或蛋白复合物等为模板，但是这些模板分子的制备和纯化困难；另外，以这些蛋白质等生物分子为模板制备的分子印迹聚合物选择性和特异性不高，原因在于这些分子被纯化后的构型和在微生物表面的构型不同，导致特异性不高。为了解决这些问题，本专利技术提出直接以革兰氏阴性菌为模板，能够克服以从微生物表面纯化的蛋白质、肽段或蛋白复合物等生物分子为模板的缺点，并以苯硼酸硅烷化试剂为功能单体，能够选择性和微生物表面的糖链（比如脂多糖，大量存在于革兰氏阴性菌表面）反应，并基于硅烷化试剂的溶胶凝胶聚合反应，在常温条件下采用一锅法制备出革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子，制备简单，成本低，所得产物能够对目标菌进行特异性识别和检测分析。
[0008]为解决现有技术问题，本专利技术采取的技术方案为：一种检测革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：步骤一. 将浓度为106‑
10
8 CFU/mL的模板菌加入溶液中，再加入浓度为4.7
‑
9.4
µ
mol/mL功能单体和浓度为0.1
‑
0.4
µ
mol/mL的荧光单体进行预组装，获得分子印迹预聚液，所述模板菌为革兰氏阴性菌；步骤二. 向步骤一制备的分子印迹预聚液中依次加入浓度为100
‑
1000 mM交联剂和质量浓度2
‑
10 %引发剂，搅拌聚合溶液，生成分子印迹荧光纳米粒子，这些纳米粒子吸附在模板菌表面；步骤三. 用洗脱溶液去除步骤二中的模板菌，得到能够特异性识别目标细菌的分子印迹荧光纳米粒子。
[0009]作为优选，步骤一中所述模板菌为大肠杆菌O157:H7或荧光假单胞菌，所述溶液为磷酸盐缓冲液和乙醇的混合液，且乙醇的体积分数为5
‑
15 %。
[0010]作为优选，步骤一中功能单体的浓度为4.7
µ
mol/mL，荧光单体的浓度为0.2
µ
mol/mL，模板菌的浓度为 0.42*10
8 CFU/mL，磷酸盐缓冲液和乙醇的混合液中乙醇的体积分数为15%。
[0011]作为优选，步骤二中所述交联剂的浓度为 849 mM，引发剂的质量分数为6%。
[0012]作为优选，步骤二中交联剂为四乙氧基硅烷或四甲氧基硅烷，所述引发剂为氨水，搅拌速度为700
‑
1500rpm。
[0013]作为优选，步骤一中功能单体为苯硼酸硅烷化试剂，通过醛基苯硼酸和氨基硅烷化试剂按照摩尔比1:1在乙醇中一步反应获得；荧光单体可以通过含有异氰酸酯或异硫氰酸酯的荧光染料和氨基硅烷化试剂按照摩尔比1:1在乙醇中一步反应获得，所得功能单体和荧光单体无需纯化。
[0014]作为优选，所述醛基苯硼酸为3
‑
甲酰基苯硼酸，2
‑
甲酰基苯硼酸，4
‑
甲酰基苯硼酸，2
‑
氟
‑3‑
醛基苯硼酸，4
‑
氟
‑3‑
醛基苯硼酸，或3
‑
氟
‑4‑
醛基苯硼酸中任一种。
[0015]作为优选，所述氨基硅烷化试剂为3
‑
氨基丙基
‑
三乙氧基硅烷、3
‑
氨基丙基
‑
三甲氧基硅烷、3
‑
(2
‑
氨基乙基氨基)丙基
‑
三本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一. 将浓度为106‑
10
8 CFU/mL的模板菌加入溶液中，再加入浓度为4.7
‑
9.4
µ
mol/mL功能单体和浓度为0.1
‑
0.4
µ
mol/mL的荧光单体进行预组装，获得分子印迹预聚液，所述模板菌为革兰氏阴性菌；步骤二. 向步骤一制备的分子印迹预聚液中依次加入浓度为100~1000 mM交联剂和质量浓度2
‑
10 %引发剂，搅拌聚合溶液，生成分子印迹荧光纳米粒子，这些纳米粒子吸附在模板菌表面；步骤三. 用洗脱溶液去除步骤二中的模板菌，得到能够特异性识别目标细菌的分子印迹荧光纳米粒子。2.根据权利要求1所述的一种检测革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤一中所述模板菌为大肠杆菌O157:H7或荧光假单胞菌，所述溶液为磷酸盐缓冲液和乙醇的混合液，且乙醇的体积分数为5
‑
15 %。3.根据权利要求1所述的一种检测革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤一中功能单体的浓度为4.7
µ
mol/mL，荧光单体的浓度为0.2
µ
mol/mL，模板菌的浓度为 0.42*10
8 CFU/mL，磷酸盐缓冲液和乙醇的混合液中乙醇的体积分数为15%。4.根据权利要求1所述的一种检测革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤二中所述交联剂的浓度为 849 mM，引发剂的质量分数为6%。5.根据权利要求1所述的一种检测革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤二中交联剂为四乙氧基硅烷或四甲氧基硅烷，所述引发剂为氨水，搅拌速度...

【专利技术属性】
技术研发人员：李前进，金雨，王婷婷，王萌，王奋英，王龙凤，李建林，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：