核酸球形纳米颗粒药物、及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种核酸球形纳米颗粒药物、及其制备方法和应用，所述核酸球形纳米颗粒药物为二硫单体化合物和与检测目标正义核酸序列互补的核酸序列自组装而成。所述的核酸球形纳米颗粒药物可以通过非内吞途径进入细胞质，进而被细胞内源性谷胱甘肽(GSH)快速解聚，促使纳米颗粒的分解和核酸的释放以用于基因治疗，进而抑制肿瘤相关基因的表达。进而抑制肿瘤相关基因的表达。进而抑制肿瘤相关基因的表达。

【技术实现步骤摘要】
核酸球形纳米颗粒药物、及其制备方法和应用
[0001]本申请是2019年3月8日申请的专利技术名称为“一种核酸球形纳米颗粒药物的制备方法及应用”、申请号为201910176094.0的专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术属于生物基因治疗领域，特别涉及一种核酸球形纳米颗粒药物、及其制备方法和应用。

技术介绍

[0003]基因治疗对于治疗癌症、遗传性疾病及病毒感染等多种疾病具有广阔的应用前景。目前，许多核酸药物正处于临床试验阶段，并且一些药物已在美国和欧洲获得批准。尽管取得了很大的进步，核酸药物的商业开发仍然面临一些挑战，比如酶促降解、低效的细胞质递送、肝脏的快速清除及非特异性副作用。
[0004]成功的基因治疗在很大程度上取决于发展高转染效率、低细胞毒性的递送载体。病毒和非病毒载体均可用于包装核酸，并促进细胞的摄取。病毒载体被广泛地用于有效的基因递送；然而，安全问题和低产量限制了它们的应用。同时，各种非病毒纳米材料在基因递送方面显示出巨大的潜力。近年来，人们设计了核酸组装纳米结构用于基因递送，例如：球形核酸(SNA)、DNA纳米结构和DNA水凝胶。尽管具有良好的生物相容性、细胞内化率，但细胞通过内吞途径摄取核酸组装纳米结构，从而导致内涵体/溶酶体捕获和降解，是该技术目前的主要瓶颈。例如，SNA通过内吞途径进入晚期内涵体，并在孵育后停留在晚期内涵体长达24小时。这些颗粒中只有一小部分能够从内涵体中逃逸到细胞质，极大地限制了它们的治疗效率。因此，急需开发出新的非病毒载体以促进内涵体/溶酶体逃逸并提高治疗效率。
[0005]膜融合和硫醇交换介导等不依赖内吞作用的细胞摄取途径，在生物分子的递送方面显示出很大的潜力，尤其是硫醇交换途径引起了极大关注。目前报道的硫醇交换途径主要是通过细胞穿透的二硫聚合物(Cell
‑
Penetrating Poly(disulfide)s，CPD)。CPD是聚精氨酸细胞穿透肽的合成模拟物，其中多肽骨架被二硫聚合物取代。CPD修饰的货物，如量子点、蛋白质、纳米粒子等，可以通过硫醇交换途径直接进入细胞质。然而，基于CPD的递送方法需要耗时的合成及共价修饰，这可能会影响生物分子的生物活性。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于提供了核酸球形纳米颗粒药物用于高效的细胞质基因递送，解决现有递送方法存在的递送效率低的问题。所述核酸至少包含一个与检测目标正义核酸序列互补的核酸序列，所述核酸球形纳米颗粒为二硫单体化合物和与检测目标正义核酸序列互补的核酸以自组装的形式合成。所述的核酸球形纳米颗粒药物以非内吞途径进入细胞质，进而被细胞内源性谷胱甘肽(GSH)快速解聚，导致纳米球的分解和核酸的释放以用于反义基因治疗，从而抑制肿瘤相关基因的表达。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种核酸球形纳米颗粒药物，所述的核酸球形纳米颗粒药物包括核酸、二硫单体化合物，其中二硫单体化合物结构通式如下：
[0009][A]‑
R
‑
[M]，
[0010]其中，A含有一个或多个二硫键S
‑
S基团；
[0011]R为碳链骨架；
[0012]M为一带正电基团。
[0013]所述的核酸包含一个或多个与目标正义核酸互补的序列。
[0014]所述的核酸包括DNA，siRNA，miRNA中的一种或多种。
[0015]所述的二硫单体化合物的A基团为疏水区域。
[0016]所述的核酸球形纳米颗粒药物的形成作用力是通过核酸分子的磷酸基团PO4‑
和正电基团M之间形成的多个盐桥牢固地粘附到核酸模板，形成核酸/寡聚体复合物，进一步形成纳米颗粒。
[0017]核酸球形纳米颗粒药物的制备方法，包括以下步骤：(1)将核酸与二硫单体化合物在Tris
‑
HCl缓冲液中混合搅拌；(2)透析，除去未反应的核酸和二硫单体化合物，得到核酸球形纳米颗粒。
[0018]所述二硫单体化合物中的M基团电荷数与核酸中的磷酸基团的摩尔比为1～15。
[0019]进一步地，将核酸球形纳米颗粒药物应用于制备抑制肿瘤药物中。
[0020]所述核酸球形纳米颗粒通过非内吞途径，即硫醇交换途径直接进入细胞；核酸球形纳米颗粒药物进入细胞后，在内源性谷胱甘肽的作用下，核酸球形纳米颗粒解聚并释放核酸，进而与目标正义核酸互补配对，抑制所述目标正义核酸表达。
[0021]所述的目标正义核酸包括mRNA、siRNA、microRNA中的一种或多种。
[0022]本专利技术的技术方案相比于现有技术至少达到如下有益效果：
[0023](1)本专利技术的一种核酸球形纳米颗粒药物，是二硫单体化合物通过M正电基团与核酸的磷酸基团(PO4‑
)之间形成的多个盐桥牢固地粘附到核酸模板，使二硫单体化合物紧密接近，从而大大增加了它们的局部有效浓度。
[0024](2)本专利技术的一种核酸球形纳米颗粒药物，是由二硫聚合物与肿瘤相关的基因互补的核酸组装而成，与单纯的核酸的基因治疗相比，所述的核酸球形纳米颗粒药物具有更好的稳定性。
[0025](3)本专利技术的一种核酸球形纳米颗粒药物，是在Tris
‑
HCl缓冲液中由二硫单体化合物与肿瘤相关的基因互补的核酸序列自组装而成，可以通过非内吞途径，即硫醇交换途径直接有效地进入细胞质，与现有的脂质体包裹核酸的基因递送方法相比，具有合成方法简单、不易被内涵体/溶酶体降解等优点。
[0026](4)本专利技术的一种核酸球形纳米颗粒药物，其中核酸的长度可根据肿瘤相关基因的正义核酸的链长自由调整，形成的纳米颗粒，能够更有效地进入细胞，抑制正义核酸的翻译，从而更有效地抑制靶标蛋白的表达进而抑制细胞的增殖。
[0027]因此，本专利技术的核酸球形纳米颗粒药物能够更有效地用于基因治疗。
附图说明
[0028]图1为DNA球形纳米颗粒的形成过程及在基因治疗方面应用的示意图。
[0029]图2分别为实施例1中的DNA
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18nt形成DNA球形纳米颗粒的表征图。(a)扫描电镜图；(b)透射电镜图；(c)粒径大小图；(d)合成的DNA球形纳米颗粒的Zeta电位。标尺：100nm。
[0030]图3为DNA球形纳米颗粒合成及解聚的聚丙烯酰胺电泳图。(a)优化DNA和二硫单体化合物比例，形成纳米颗粒的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。(b)加GSH或细胞裂解液，DNA球形纳米颗粒解聚的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0031]图4为实施例1中DNA NPs
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18nt与细胞共孵育不同的时间进细胞的共聚焦图。(a)DNA NPs
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18nt进细胞情况的共聚焦图；(b)DNA NPs
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18nt在HeLa细胞内的亚细胞定位共聚焦图像。
[0032]图5为实施例1中HeLa细胞与不同浓度DNA NPs
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18nt或DNA 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸球形纳米颗粒药物，其特征在于，所述的核酸球形纳米颗粒药物包括核酸、二硫单体化合物，其中二硫单体化合物结构通式如下：[A]
‑
R
‑
[M]，其中，A为R为碳链骨架；M为一带正电基团；所述的核酸球形纳米颗粒药物的形成作用力是通过核酸分子的磷酸基团PO4‑
和正电基团M之间形成的多个盐桥牢固地粘附到核酸模板，形成核酸/寡聚体复合物，进一步形成纳米颗粒；所述二硫单体化合物中的M基团电荷数与核酸中的磷酸基团的摩尔比为1～15；所述的核酸包含一个或多个与目标正义核酸互补的序列。2.根据权利要求1所述的核酸球形纳米颗粒药物，其特征在于，所述的核酸包括DNA，siRNA，miRNA中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的核酸球形纳米颗粒药物，其特征在于，所述的核酸与肿瘤相关的基因互补。4.一种核酸球形纳米颗粒药物，其特征在于，所述的核酸球形纳米颗粒药物包括核酸、二硫单体化合物，其中二硫单体化合物结构通式如下：[A]
‑
R
‑
[M]，其中，A为R为碳链骨架；M为一带正电基团；所述的核酸包括单链DNA，所述的核酸包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娟，孙丽芹，周洁，李婧影，杨黄浩，
申请(专利权)人：苏州维益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：