一种嵌入式搭载siRNA的四面体框架核酸及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种特殊设计的四面体框架核酸，它是内部嵌入了siRNA的四面体框架核酸。本发明专利技术通过碱基互补配对，使目的siRNA的两端均连接到四面体框架核酸上，从而将目的siRNA嵌入到载体框架中，实现对siRNA的保护性搭载，提高siRNA的入胞能力。同时，利用pH响应性开关进一步实现siRNA在靶细胞的动态释放，实现了siRNA的可控性递送。siRNA的可控性递送。siRNA的可控性递送。

【技术实现步骤摘要】
NO.1～4所示。
[0010]更进一步地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。
[0011]本专利技术还提供了一种前述四面体框架核酸的制备方法，它包括如下步骤：
[0012]取四条DNA单链与siRNA的意义链和反义链，加入到TM缓冲液中，95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得。
[0013]进一步地，所述四条DNA单链与siRNA的意义链和反义链的终浓度均为1000nM。
[0014]本专利技术最后提供了一种前述四面体框架核酸在制备抗炎药物中的用途。
[0015]本专利技术通过四面体框架核酸(tFNA)的外框架上特定的碱基序列CGAGAAGGGCATCTC和GGATCTTCAGACTTA，与目的siRNA碱基互补配对，使目的siRNA成功嵌入四面体框架核酸内部，实现对siRNA的保护性搭载，并通过tFNA外框架上4段重复的CCCCC，成功构建了pH响应性开关，使tFNA能够在进入细胞溶酶体后实现从关闭结构到开放结构的转换，从而使得所递送的siRNA能够从载体上释放出来，发挥相应的基因沉默作用。
[0016]本专利技术相对现有的技术中的四面体框架核酸具体有益效果如下：
[0017]1、实现对siRNA的保护性搭载
[0018]通过将siRNA嵌入到tFNA内部，加强所包裹的siRNA的抗RNA酶能力，并增强其在血清中的稳定性，提高其在37℃(作用温度下)的搭载稳定性，降低其脱落风险，提高siRNA有效载荷。
[0019]2、提高tFNA的入胞能力
[0020]利用tFNA原本的内部空间，通过嵌入式的siRNA搭载方式，使搭载siRNA后对tFNA的尺寸无明显影响，因此很好地保留tFNA优异的入胞的能力。
[0021]3、降低siRNA潜在的免疫原性
[0022]siRNA存在潜在的免疫原性，由于tFNA在前期研究中被证实具有良好的生物相容性，无细胞毒性。在被包裹到tFNA后，siRNA在递送过程中不容易被免疫细胞识别和摄取，因此避免了潜在的免疫原性，生物安全性良好。
[0023]4、可搭载的siRNA的多样性
[0024]本专利技术采用的tFNA边长为30bp，嵌入了长度为25bp的能够沉默TNFαmRNA的前体siRNA。对于常规21
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25bp长度的其他siRNA来说，是具有普适性的。能够根据研究需要以及治疗需要将siRNA调整为相应的目的siRNA。
[0025]5、实现siRNA在靶细胞的动态释放
[0026]通过调整tFNA合成的序列，在框架上增加pH响应性序列，使tFNA能够在进入细胞溶酶体后实现从关闭结构到开放结构的转换，从而使得所递送的siRNA能够从载体上释放出来，并进一步进入细胞质内发挥相应的基因沉默作用。
[0027]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0028]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
附图说明
[0029]图1tFNA
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siR的原子力显微镜(AFM)图
[0030]图2tFNA
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siR的透射电镜(TEM)图
[0031]图3动态光散射测量tFNA
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siR的粒径结果
[0032]图4tFNA
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siR在pH8与pH5条件下的圆二色谱仪扫描结果
[0033]图5酶标仪测得tFNA
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siR在不同pH条件下的荧光强度变化
[0034]图6游离siRNA和tFNA
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siR在不同浓度的RNaseA中孵育1小时后的降解直观的折线图
[0035]图7游离siRNA和tFNA
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siR在1U/mL RNaseA中孵育不同时间后的降解直观的折线图
[0036]图8游离siRNA和tFNA
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siR在不同浓度的胎牛血清中孵育24小时后的降解直观的折线图
[0037]图9游离siRNA和tFNA
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siR在10％浓度的血清中孵育不同时间后的降解直观的折线图
[0038]图10在室温下常规pH8缓冲液中得到的tFNA、tFNA
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siR、tFNA(s)和tFNA(s)
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siR的5％PAGE电泳图
[0039]图11在37℃下常规pH8缓冲液中得到的tFNA、tFNA
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siR、tFNA(s)和tFNA(s)
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siR的5％PAGE电泳图
[0040]图12在37℃下pH5的酸性缓冲液中得到的tFNA、tFNA
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siR、tFNA(s)和tFNA(s)
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siR的5％PAGE电泳图
[0041]图13共聚焦荧光显微镜下观察tFNA
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siR和溶酶体的共定位情况(绿色荧光信号：Lyso Tracker标记溶酶体；紫色荧光信号：Cy5标记tFNA
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siR；蓝色荧光信号：Hochst标记细胞核。Merge图中绿色箭头指示从溶酶体中逃逸出的tFNA
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siR的Cy5荧光信号，红色箭头指示溶酶体与tFNA
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siR的信号重叠的情况，也就是尚未从溶酶体中逃逸的tFNA
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siR)
[0042]图14转染游离siRNA、tFNA、tFNA
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siR、tFNA(s)
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siR和lipo3000
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siR的巨噬细胞刺激后的mRNA水平的qPCR分析。
[0043]图15转染游离siRNA、tFNA、tFNA
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siR、tFNA(s)
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siR和lipo3000
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siR的巨噬细胞刺激后分泌的TNFα蛋白的ELISA分析。
具体实施方式
[0044]实施例1、本专利技术嵌入式搭载siRNA的四面体框架核酸的制备、表征及应用
[0045]1、tFNA
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siRNA(tFNA
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siR)的合成：
[0046]1)tFNA由4条DNA单链形成边长30bp的外框架，其中
[0047]S1(SEQ ID NO.1)：
[0048]TACGGGTAGGCCGAGACTACTATGGCGTGCAGCAGCTGGTGATAAAACCCCCTAACCCCCTAACCCCCTAACCCCC
[0049]S2(SEQ ID NO.2)：
[0050]CTCGGCCTACCCGTACGA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种四面体框架核酸，其特征在于：它是内部嵌入了siRNA的四面体框架核酸。2.根据权利要求1所述的四面体框架核酸，其特征在于：它是内部通过碱基互补配对嵌入了siRNA的四面体框架核酸。3.根据权利要求2所述的四面体框架核酸，其特征在于：所述四面体框架核酸的四条DNA单链边长30bp。4.根据权利要求3所述的四面体框架核酸，其特征在于：所述四面体框架核酸的四条DNA单链中一条DNA单链序列包含4段重复的CCCCC。5.根据权利要求4所述的四面体框架核酸，其特征在于：所述四面体框架核酸的四条DNA单链中一条DNA单链序列包含ACCCCCTAACCCCCTAACCCCCTAACCCCC，一条DNA单链序列包含CGAGAAGGGCATCTC，一条DNA单链序列包含G...

【专利技术属性】
技术研发人员：林云锋，高阳，蔡潇潇，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：