希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法技术

本发明专利技术公开了希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法。旨在利用异源表达技术及基因工程手段，构建一种重组质粒，将木糖和葡萄糖摄取进入细胞和利用代谢的关键基因引入菌株S114中，重构希瓦氏菌的代谢通路，获得的工程重组希瓦氏菌S163能够在以木糖、葡萄糖为唯一碳源或二者混糖作为碳源进行生长代谢，从而拓宽希瓦氏菌的可用底物谱。S163在混合糖为碳源的改良M9液体培养基中有氧发酵24h后到达生长平台期，生物量是WT的14.18倍，培养基中的木糖在12h后消耗约24.13％，96h后消耗约72.4％，葡萄糖在12h后消耗约74.87％，24h内被消耗完毕；产电数据表明：输出电压，是WT的12.30倍，功率密度是WT功率密度的20.47倍。功率密度是WT功率密度的20.47倍。功率密度是WT功率密度的20.47倍。

【技术实现步骤摘要】
希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法


[0001]本专利技术属于基因工程和生物代谢
，更具体的说是设计重组质粒以改造希瓦氏菌的代谢通路，使其以木糖或葡萄糖底物为唯一碳源或两种碳源共利用进行生长代谢。

技术介绍

[0002]基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术或DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，使外源基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种或生产新产品。
[0003]葡萄糖(Glucose)(化学式C6H
12
O6)，简称为葡糖。化学名称：2，3，4，5，6
‑
五羟基己醛，是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，它是一种多羟基醛。纯净的葡萄糖为无色晶体，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。葡萄糖在生物学领域具有重要地位，植物可通过光合作用产生葡萄糖，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。葡萄糖进入红细胞是协助扩散进入细胞内的，进入其他细胞的过程则是主动运输，均需要载体蛋白的参与。进入细胞内的葡萄糖经过EMP途径
→
三羧酸循环
→
呼吸链完全氧化为二氧化碳和水，并从中产生出能量。
[0004]木糖(Xylose)(化学式C5H
10
O5)，别称：五碳醛糖。是木聚糖的一个组分，木聚糖广泛存在于植物中，一般可由木屑、稻草、玉米芯等富含半纤维素的植物经水解而得的一种五碳糖，储量丰富。白色细小结晶或粉末，易溶于热乙醇和嘧啶，可溶于水。木糖与葡萄糖的化学性质相似，可以还原为相应的醇，主要用于制取木糖醇，作为底物发酵生产生物乙醇等，在食品加工、制药工业也有广泛应用，可用于染色和制革，由于人体无法消化，不能利用，也被用作无热量甜味剂。能够利用木糖的微生物体内一般包含4种木糖代谢路径：木糖氧化还原酶路径、木糖异构酶路径、Weimberg路径、Dahms路径等，此外，还有近期在大肠杆菌中构建的木糖
‑1‑
磷酸酯(Xylulose
‑1‑
phosphate，X
‑1‑
P)及核糖
‑1‑
磷酸酯(Ribulose
‑1‑
phosphate，R
‑1‑
P)途径。
[0005]相比于其他木糖代谢路径，来自于新月丙杆菌(Caulobacter crescentus)的Weimberg木糖代谢路径反应步骤具有较大的热力学吉布斯自由能差值，使得反应更容易自发进行，同时终产物α
‑
酮戊二酸可以直接进入三羧酸循环，可以绕过磷酸戊糖途径，代谢流程相对较短，代谢过程不产生二氧化碳，没有碳损失。Weimberg木糖代谢路径中D
‑
木糖在五个酶促步骤中被氧化成三羧酸(TCA)循环中间体α
‑
酮戊二酸。首先，D
‑
木糖在XylB(Cc)基因编码的D
‑
木糖脱氢酶(D
‑
xylose dehydrogenase,XDH)的作用下被氧化生成D
‑
木糖
‑
γ
‑
内酯，然后在XlyC(Cc)基因编码的D
‑
木糖
‑
γ
‑
内酯内酯酶(xylonolactonase,XLA)的催化下进一步转化为中间体D
‑
木糖酸盐，D
‑
木糖酸盐通过D
‑
木糖酸脱水酶(D
‑
xylonate dehydratase,XAD,由XylD(Cc)编码)和2
‑
酮
‑3‑
脱氧
‑
d
‑
木糖酸脱水酶(KDX dehydratase,KDXD,由XylX(Cc)编码)进行两次脱水反应，产生2
‑
酮
‑3‑
脱氧
‑
d
‑
木糖酸(2
‑
keto
‑3‑
deoxy
‑
D
‑
xylonate,KDX)，然后产生α
‑
酮戊二酸半醛(α
‑
ketoglutarate semialdehyde,KGSA)。在最后一步，半醛被α
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酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSA dehydrogenase,KGSADH,由XylA(Cc)编码)以NAD(P)+依赖的方式被氧化成α
‑
酮戊二酸进入三羧酸循环，参与代谢。
[0006]希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)属是一种兼性厌氧菌，遗传背景清晰，且易于操作。模式产电微生物
‑
奥达奈希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR
‑
1简称MR
‑
1，ATCC编号：700550)是希瓦氏菌属中在基因组序列注释和遗传特性方面研究最广泛的菌株。该菌株能够在不添加外源媒介的情况下，将电子转移到微生物燃料电池中的阳极，成为研究微生物如何在MFC中产生电流的模式生物之一。野生型希瓦氏菌一般以乳酸为底物进行生长代谢，不能利用葡萄糖、木糖等糖类作为碳源代谢生长或产电，使得菌种可利用底物谱过窄，胞外电子传递效率较低。
[0007]本专利技术旨在通过异源表达技术，结合基因工程等手段，将葡萄糖利用代谢的关键基因和木糖利用代谢的Weimberg代谢路径关键基因引入MR
‑
1中，使希瓦氏菌能够在以葡萄糖为唯一碳源、木糖唯一碳源及葡萄糖
‑
木糖混合碳源的改良后M9液体培养基中进行生长代谢，从而拓宽希瓦氏菌的可用底物谱。

技术实现思路
：
[0008]为了解决现有技术的问题，本专利技术提出如下技术方案：
[0009]一种希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR
‑
1，简称MR
‑
1)中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法，采用biobrick的构建策略，利用同尾酶SpeI与XbaI，处理后产生相同的粘性末端，在T4 DNA连接酶的作用将木糖、葡萄糖转运蛋白基因及木糖Weimberg代谢路径和葡萄糖代谢相关基因构建于同一个重组质粒表达载体上，将重组质粒通过物理转化、接合转移的方式导入到宿主菌S114中获得以葡萄糖、木糖唯一碳源及葡萄糖
‑
木糖混糖为碳源共利用的工程希瓦氏菌株S163。
[0010]所述重组工程菌株构建方法，利用同尾酶SpeI(酶切位点：ctag)与XbaI(酶切位点：ctag)，处理后产生相同的粘性末端，在T4 DNA连接酶的作用下将分别来自中间假丝酵母(Candida intermedia，简称C.interme本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法，其特征在于：采用biobrick的构建策略，利用同尾酶SpeI与XbaI，处理后产生相同的粘性末端，在T4 DNA连接酶的作用下将木糖、葡萄糖转运蛋白基因及木糖Weimberg代谢路径和葡萄糖代谢相关基因构建于同一个重组质粒表达载体上，将重组质粒通过物理转化、接合转移的方式导入到宿主菌S114中获得以葡萄糖或木糖为唯一碳源及葡萄糖
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木糖混糖为碳源共利用的重组工程菌株：希瓦氏菌株S163。2.根据权利要求1所述希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法，其特征在于：所述重组质粒的合成方法为：利用同尾酶SpeI(酶切位点：ctag)与XbaI(酶切位点：ctag)，处理后产生相同的粘性末端，在T4 DNA连接酶的作用下将分别来自中间假丝酵母的木糖转运蛋白的基因gxf1(SEQ ID NO.5)和来自新月丙杆菌的木糖Weimberg代谢路径相关基因xylB(SEQ ID NO.6)，xylC(SEQ ID NO.7)，xylD(SEQ ID NO.8)，xylX(SEQ ID NO.9)，xylA(SEQ ID NO.10)，来自大肠杆菌的葡萄糖转运及代谢相关基因glf(SEQ ID NO.11)，glk(SEQ ID NO.12)，edd(SEQ ID NO.13)经过密码子优化后，按照gxf1
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xy...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋浩，王川东，李锋，马媛媛，张君奇，尹静，杨池，
申请(专利权)人：天津大学青岛海洋工程研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：