本发明专利技术公开了一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法及应用，本发明专利技术涉及细菌菌剂固定化技术领域，主要包括：以原桃胶为原料合成纳米磁铁矿；将所述原桃胶制备成溶液，添加0.5倍质量的海藻酸钠，与一定浓度桃胶合成的纳米磁铁矿、产氢细菌菌悬液混匀，滴加至CaCl2溶液中，形成固定化凝胶珠。所述固定化凝胶珠应用于木质纤维素水解液发酵产氢系统，能使该系统活菌数增加，使发酵120h的累积产氢量提高约60％，水解液中葡萄糖和木糖利用率显著提高。本发明专利技术以原桃胶为原料制备的纳米磁铁矿作为添加剂、以原桃胶作为主要固定化载体制备了产氢细菌高效固定化菌剂，方法简便，条件温和，稳定性好，细菌存活率高，促产氢效果显著。促产氢效果显著。促产氢效果显著。
【技术实现步骤摘要】
一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法及应用
[0001]本专利技术涉及一种新型耦合纳米材料固定化剂的制备方法及应用领域，特别是涉及由原桃胶作为原料合成纳米磁铁矿并耦合桃胶固定化剂的制备方法及其应用，尤其涉及该新型固定化剂在调控产氢细菌生物氢合成中的效果，应用于生物氢能源高效合成与调控领域。
技术介绍
[0002]固定化产氢细菌细胞技术以其能增加系统稳定性、扩大产氢细菌活性范围，提高系统耐受pH变化能力等，已成为提高细菌产氢能力的重要技术。固定化细胞方法按照固定化载体与作用方式的不同，可分为包埋法、系统截留法、吸附法和交联法。包埋法是细胞固定化最常用的方法，包埋载体主要利用天然高分子多糖类和合成高分子化合物。天然高分子多糖类的琼脂、海藻酸钙和卡拉胶应用最多，具有固定化成形方便，对微生物毒性小及固定化密度高等优点，但其抗微生物分解性能较差，机械强度较低。合成高分子化合物中主要利用聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光硬化树脂等，其突出优点是抗微生物分解性能好、机械强度高、化学性能稳定，但其聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大，而且成形的多样性和可控性不好。为此，开发新型固定化剂对于有效提高产氢细菌的生物氢产量至关重要。
[0003]桃胶是蔷薇科植物桃或山桃等树皮中分泌出来的胶状物质。一般将未经过任何处理的桃胶称为原桃胶，原桃胶为桃红色或淡黄色至黄褐色半透明固体块状，外表平滑。原桃胶分子量大，有较好的吸附性能，在医学上，由于其不被胃液分解，通常作为一种天然囊材，制成水凝胶用于包埋药物；在食品工业中，其可制备为微胶囊用于包埋鱼油等保健品。可见，原桃胶具备作为包埋载体的基本特性，可望用作新型的固定化载体。
[0004]近年来，在发酵产氢系统中添加一定浓度纳米颗粒可有效促进生物氢产率的提高，据报道，纳米颗粒的表面效应和量子尺寸效应可以通过加速电子从NADPH向氢酶的转移来提高其酶活性，从而促进生物氢的合成。为此，纳米颗粒的添加已成为促进生物氢合成的重要调控方式。尤其是以天然植物及其提取物为原料绿色合成的纳米颗粒添加至发酵产氢系统，亦可起到较好的促产氢效果，并且，采用绿色法合成纳米颗粒具有条件温和、制备工艺简单、成本低廉等优点，目前已逐渐成为重要的纳米颗粒合成方式。原桃胶作为一种天然原料，其化学成分除主要包括原桃胶多糖外，还包括苏氨酸、组氨酸等常见氨基酸和K、Ca、Mg、Fe、Mn等微量元素。因此，以原桃胶为原料，亦可用于纳米颗粒的绿色合成，作为促产氢剂添加至发酵产氢系统。
[0005]综上，固定化技术的采纳及纳米颗粒的添加均是促进产氢细菌生物氢合成的有效措施。基于原桃胶作为原材料的固定化耦合纳米颗粒添加可望开发一种低成本、高效促进生物氢合成的产氢细菌固定化方式，拟解决生物制氢效率低的关键技术问题。
技术实现思路
[0006]本专利技术所要解决的技术问题：本专利技术旨在提供一种用于固定化产氢细菌细胞的固定化方法，该方法具有固定化效率高、产氢细菌菌剂活性强、稳定性好、成形方便且可控等特点，可以提高产氢细菌的生物氢合成量、细菌存活率、木质纤维素水解液葡萄糖和木糖的利用率。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供以下的技术方案：
[0008]一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法，具体步骤如下：
[0009](A)称取4g桃胶粉加入100mL蒸馏水中，置于80℃水浴锅中恒温处理8h，使桃胶粉全部溶胀，形成桃胶液；获得的桃胶液适当冷却后，加入2g海藻酸钠，充分混匀后，灭菌得原桃胶/海藻酸钠溶液；
[0010](B)取生长至对数期的产氢细菌，按照0.5g
菌体
/10mL
原桃胶/海藻酸钠溶液
比例添加至原桃胶/海藻酸钠溶液中，混匀，再添加一定浓度(0～50mg/L)无菌的绿色合成纳米磁铁矿，用灭菌医用注射器匀速滴入无菌氯化钙溶液中，待凝胶珠成形后钙化1～2h，弃去多余的氯化钙溶液，再用灭菌的生理盐水洗涤，即得固定化凝胶珠。
[0011]优选地，所述产氢细菌为阴沟肠杆菌、产氢克雷伯氏菌、产氢克雷伯氏菌工程菌中的一种或多种。
[0012]优选地，所述生长至对数期的产氢克雷伯氏菌菌体细胞的制备方法为：挑取活化的产氢克雷伯氏菌单菌落于液体培养基中过夜培养，进一步低速离心，弃上清液、收集菌体，用生理盐水洗涤2～3次，弃上清、收集菌体，用于固定化凝胶珠制备；所述液体培养基配方为：D
‑
木糖10g，葡萄糖10g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH2PO
4 0.5g，MgSO4·
7H2O 1g，pH7.5，水1000mL。
[0013]优选地，所述的无菌的绿色合成纳米磁铁矿为原桃胶合成的纳米磁铁矿于121℃灭菌20min制得；所述的无菌氯化钙溶液为10g/L的氯化钙水溶液于121℃灭菌20min制得。
[0014]优选地，所述原桃胶合成的纳米磁铁矿按如下方法制备：
[0015](1)称取1g桃胶粉加入100mL蒸馏水中，置于80℃水浴锅中恒温处理8h，使桃胶粉全部溶胀，形成桃胶液；进一步调节pH值为10～11，置于恒温磁力搅拌器上，85℃加热搅拌3h后，再降温至50℃，向桃胶溶液中加入一定体积的0.5mol/L Fe
3+
及0.75mol/L Fe
2+
溶液，使混合液中Fe
3+
：Fe
2+
＝2：1，置于恒温磁力搅拌器上，于60℃下连续搅拌4h；
[0016](2)上述反应液冷却至室温，边搅拌边缓慢加入新配制的2mol/L NaOH溶液至沉淀全部转变为黑色，再于80℃连续搅拌反应1h；
[0017](3)反应完成后，将步骤(2)的反应液静置、冷却，用永磁体对获得的纳米颗粒进行分离，用无水乙醇和蒸馏水分别洗涤3次，离心，收集沉淀置于70℃恒温干燥箱中烘干至恒重；烘干物取出、研磨、过200目筛，即得桃胶绿色合成的纳米磁铁矿。
[0018]优选地，所述Fe
3+
盐为三氯化铁；所述Fe
2+
盐为硫酸亚铁。
[0019]一种上述固定化凝胶珠在发酵产氢中的应用，所述固定化凝胶珠按一定接种量(0.1g
菌体
/100mL
培养基
，按菌体量计)接种至稻草水解液发酵培养基中，定期检测氢气体积、葡萄糖和木糖浓度及产氢细菌活细胞数，共发酵120h；所述稻草水解液发酵培养基配方为：稻草水解液1000mL，牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH2PO
4 0.5g，MgSO4·
7H2O 0.5g，糖浓度50g/L，pH 8.0。
[0020]本专利技术获得的有益效果：
[0021]1)本专利技术采用原桃胶为原材料合成纳米磁铁矿并作为主要固定化载体用于细菌发酵产氢系统，原材料产量高、成本低廉，操作步骤简单，反应条件温和、易于控制、安全环保。
[0022]2)本专利技术所制得的以原桃胶作为主要固定化载体耦合绿色合成纳米磁本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法，其特征在于，具体步骤如下：(A)称取桃胶粉加入蒸馏水中，置于80℃水浴锅中恒温处理8h，使桃胶粉全部溶胀，形成桃胶液；获得的桃胶液适当冷却后，加入海藻酸钠，充分混匀后，灭菌得原桃胶/海藻酸钠溶液；(B)取生长至对数期的产氢细菌，按照0.5g菌体/10mL原桃胶/海藻酸钠溶液比例添加至原桃胶/海藻酸钠溶液中，混匀，再添加一定浓度无菌的绿色合成纳米磁铁矿，用灭菌医用注射器匀速滴入无菌氯化钙溶液中，待凝胶珠成形后钙化1～2h，弃去多余的氯化钙溶液，再用灭菌的生理盐水洗涤，即得固定化凝胶珠。2.根据权利要求1中所述的一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法，其特征在于：所述产氢细菌为阴沟肠杆菌、产氢克雷伯氏菌、产氢克雷伯氏菌工程菌中的一种或多种。3.根据权利要求2中所述的一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法，其特征在于：所述生长至对数期的产氢克雷伯氏菌菌体细胞的制备方法为：挑取活化的产氢克雷伯氏菌单菌落于液体培养基中过夜培养，进一步低速离心，弃上清液、收集菌体，用生理盐水洗涤2～3次，弃上清、收集菌体，用于固定化凝胶珠制备；所述液体培养基配方为：D
‑
木糖10g，葡萄糖10g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH2PO
4 0.5g，MgSO4·
7H2O 1g，pH7.5，水1000mL。4.根据权利要求1中所述的一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化方法，其特征在于：所述的无菌的绿色合成纳米磁铁矿为原桃胶合成的纳米磁铁矿于121℃灭菌20min制得；所述的无菌氯化钙溶液为10g/L的氯化钙水溶液于121℃灭菌20min制得。5.根据权利要求4中所述的一种提高产氢细菌生物氢合成的固定化...
【专利技术属性】
技术研发人员：张琴，张永贵，许思远，曹娟娟，赵沛，叶景，钱程，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：
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