一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用。本发明专利技术利用细胞球培养板三维培养技术，制备无支架牙周膜干细胞球并将无支架牙周膜干细胞球应用到成骨分化相关的组织工程。本发明专利技术的无支架牙周膜干细胞球具有良好的稳定性和生物活性，及较强的成骨分化效能，可用作牙周组织工程、骨组织工程领域中的细胞骨替代材料或与支架材料结合运用，提高成骨效能。通过该发明专利技术培养收集所得的无支架牙周膜干细胞球大小均匀一致，能够维持较长时间的细胞活性；与此同时，本发明专利技术制备方法可重复，简便易行，不需要依赖大型设备或装置，有利于快速有效获得细胞球结构。胞球结构。胞球结构。

【技术实现步骤摘要】
一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，尤其是涉及一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]目前，传统的细胞培养以培养瓶或培养皿为代表的二维培养模式为主。该培养模式并不具备活体组织的空间形态，在培养过程中，细胞往往出现某一特定组织性质丢失的情况。在真实的人体环境中，相邻细胞之间以及胞外基质间相互渗透沟通，形成立体的空间组织，构成复杂的生物化学信号网络，这一结构对细胞的正常生理活动意义重大。多数情况下，二维细胞培养方法体外研究所得结果与体内实验不相符合，一方面与细胞在体外环境下随着传代次数的增多逐渐丧失其原有性状有关，另一方面也与体内实验受到多种因素和复杂环境影响所致。为了尽可能真实地模拟细胞所处的体内微环境，越来越多的研究开始关注细胞三维培养。
[0003]研究发现，细胞球成球机理主要与细胞的黏附和分化有关，在细胞球的形成过程中整合素、钙粘蛋白、胞外纤维等被发现或表达上调。制作细胞球的方法主要有悬滴培养(hanging drop)、利用旋转生物反应器(rotating bioreactor)培养、无黏附表面的塑料制品培养、利用外部力量制作、改变培养基成分、微基板等方法。上述方法往往存在批量生产较困难、所获得细胞球尺寸、数目及形态有差异、培养细胞类型有限，需专门设备成本高等问题。相对而言，细胞培养板法操作简便，可批量生产，逐渐应用于三维细胞培养领域。该方法以琼脂糖凝胶等为载体，利用预置尺寸的模具在6孔板、24孔板或96孔板中制作不同尺寸孔板，通过接种不同种类和数量的的细胞来制备细胞球。
[0004]牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)来源于新鲜牙周膜组织，具有很高的增殖和克隆形成能力，高表达间充质干细胞标记物STRO
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1和CD146/MCU18，具备多向分化潜能，是较为理想的牙周组织再生的种子细胞来源。研究表明相较于二维培养细胞，三维培养所得的PDLSC细胞球成骨分化能力有所提高。应用三维动态微重力装置培养PDLSCs发现，经过成骨诱导后细胞基质矿化结节有所增加，相关基因表达上调。将hPDLSCs包裹于海藻酸钠微球中，应用生物反应器模拟体内环境观察动态液流对PDLSCs生物活性的影响。经过14天成骨诱导后，细胞表现出更为显著的矿化能力，结果显示生物反应器培养有利于细胞成骨分化和矿化基质的形成。将PDLSCs接种于葡聚糖微载体，比较旋转微重力培养环境与普通重力环境对细胞生长状态的影响，发现在微重力环境下微载体表面细胞多呈半球形，细胞生长速度明显加快。与普通培养方式相比，PDLSC细胞球呈现出一定的成骨趋势。采用悬滴培养法形成牙周膜成纤维细胞球，将其与胶原/聚乙二醇膜复合，发现细胞球能黏附于膜上，免疫组化染色结果显示细胞表达Col
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I、periostin和Runx2。上述所制备的无支架牙周膜干细胞球在制备和使用过程中大多需要依赖支架材料。然而，多数支架材料的降解速度与细胞的生长分化不一定能相互协调。部分支架材料的降解产物为酸性，可能导致局部炎症的发生。支架材料在原料及配比选择、层次结构及降解性能等方面尚
有待改善，才能更真实模拟细胞外基质环境。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用。本专利技术不依赖于支架材料，由细胞自组装形成三维细胞结构。在这个三维结构中，细胞与细胞以及细胞所分泌的细胞基质直接接触。相邻细胞之间以及胞外基质间相互渗透沟通，形成立体的空间组织，构成复杂的生物化学信号网络。传统的细胞培养以培养瓶或培养皿为代表的二维培养模式为主。二维培养模式并不具备活体组织的空间形态，在培养过程中，细胞往往出现某一特定组织性质丢失的情况。然而，本专利技术中的三维细胞结构能够更好地提供类似真实人体内细胞外基质环境，增加细胞间的连接，促进细胞间的相互作用，对细胞的正常生理活动意义重大。通过该方法培养收集所得的无支架牙周膜干细胞球体积形态均一，能够维持较长时间的细胞活性，同时比二维培养细胞成骨能力显著提高，在体内可形成类骨样组织。制作方法可重复，简便易行，不需要依赖大型设备或装置，有利于快速有效获得细胞球结构。本专利技术开发具有成骨效应的无支架牙周膜干细胞球应用于组织工程领域，有很好的前景和价值。
[0006]本专利技术的专利技术目的可以通过以下技术方案来实现：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)制备细胞球培养板：配置琼脂糖溶液加入到二维细胞培养六孔板的孔中，将模具放置在六孔板的琼脂糖(agarose)溶液内，待琼脂糖溶液凝固后拔出模具，使得琼脂糖凝胶中形成井孔，即得到细胞球培养板；
[0009](2)井孔润洗：用PBS润洗细胞球培养板的每个井孔；
[0010](3)牙周膜干细胞接种：将牙周膜干细胞细胞悬液加入细胞球培养板的井孔中，井孔中加入培养液，然后将细胞球培养板放入细胞培养箱中；
[0011](4)无支架牙周膜干细胞球培养：培养1天后，更换培养液，以后每隔2天换一次培养液；
[0012](5)利用显微镜观察其生长状况，待形成无支架牙周膜干细胞球后进行收集。
[0013]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(1)中，配置琼脂糖溶液并加热，待琼脂糖溶液为液体状态时将模具沿着一侧孔边缘向另一侧边缘缓缓放入；待琼脂糖溶液凝固成形后，垂直拔出模具。
[0014]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(1)中，所述琼脂糖溶液中琼脂糖与去离子水的质量比为1：100。
[0015]在本专利技术的一个实施方式中，在接种细胞之前，需要在细胞球培养板每井孔中加入至少1ml PBS溶液进行润洗，以赶走孔中气泡并浸润球板表面，保证含有细胞的培养液能迅速渗入，避免细胞无法进入细胞球井孔。
[0016]在本专利技术的一个实施方式中，细胞球培养板每井孔接种牙周膜干细胞1.0
×
103个～1.5
×
103个，接种细胞量过少生物活性程度低，接种细胞量过大容易造成细胞球中心细胞的死亡。
[0017]在本专利技术的一个实施方式中，将细胞球培养板静置在细胞培养箱中。
[0018]在本专利技术的一个实施方式中，所述更换培养液的方式为半换液方式及沿培养板侧壁吸取培养液，即每次仅更换一半体积的培养液，避免触碰到球体；吸液或加液时需要沿着孔洞侧壁轻轻吸取或加入液体，以避免损失细胞球。
[0019]在本专利技术的一个实施方式中，细胞球在接种24小时后会形成球体。在接种初期，随着细胞增殖细胞数量增多，但细胞球呈现体积变小向中心聚集的状态。在这种状态下，可能由于营养输送不及时和废物排泄不通畅导致球体中心细胞坏死。故相较于传统培养方法中每2
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3天更换一次培养基，细胞球培养中要求培养基的更换频率为每1
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2天更换一次。并且，培养基的量要足够，6孔板本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备细胞球培养板：配置琼脂糖溶液加入到二维细胞培养六孔板的孔中，将模具放置在六孔板的琼脂糖溶液内，待琼脂糖溶液凝固后拔出模具，使得琼脂糖凝胶中形成井孔，即得到细胞球培养板；(2)井孔润洗：用PBS润洗细胞球培养板的每个井孔；(3)牙周膜干细胞接种：将牙周膜干细胞细胞悬液加入细胞球培养板的井孔中，井孔中加入培养液，然后将细胞球培养板放入细胞培养箱中；(4)无支架牙周膜干细胞球培养：培养1天后，更换培养液，以后每隔2天换一次培养液；(5)利用显微镜观察其生长状况，待形成无支架牙周膜干细胞球后进行收集。2.根据权利要求1所述的一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，配置琼脂糖溶液并加热，待琼脂糖溶液为液体状态时将模具沿着一侧孔边缘向另一侧边缘缓缓放入；待琼脂糖溶液凝固成形后，垂直拔出模具。3.根据权利要求1所述的一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述琼脂糖溶液中琼脂糖与去离子水的质量比为1：100。4.根据权利要求1所述的一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，制备细胞球培养板的过程保证无菌；制备得到的细胞球...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈静，刘月华，
申请(专利权)人：上海市口腔医院上海市口腔健康中心，
类型：发明
国别省市：