甲状腺激素干扰物的检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种甲状腺激素干扰物的检测方法及检测试剂盒，包括以下步骤：将酵母固定于培养基的表面，所述酵母含有甲状腺激素受体基因、共激活因子基因和报道基因；添加待测样本至所述培养基的表面与所述酵母进行作用；将与待测样本作用后的所述酵母进行细胞壁破碎；检测所述酵母中报道基因的表达水平。本发明专利技术建立的固定化酵母环境甲状腺激素干扰效应检测方法可直接将密度较高的酵母细胞固定覆盖在培养基表面，90天的保存期内，只需直接加入环境样本，就可以开展样品测试，无需水样前处理，无需酵母细胞临时预培养，大大降低了检测条件要求，能够适用于野外的现场检测。能够适用于野外的现场检测。能够适用于野外的现场检测。

【技术实现步骤摘要】
甲状腺激素干扰物的检测方法及检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及检测
，特别是涉及一种甲状腺激素干扰物的检测方法及检测试剂盒。

技术介绍

[0002]现阶段开展环境水样环境甲状腺激素干扰物(TDCs)的检测，多以异位检测为主，根据TDCs的理化特性开展定性、定量的仪器检测。通常需要采集环境水样，运送回实验室，经过前处理后，开展分析测试，可见现阶段环境水样TDCs的检测通常较为繁复且费时费力，最重要的是上述方法无法直接给出环境水样甲状腺激素干扰效应的信息，无法直接判断样品的甲状腺激素干扰毒性。
[0003]与上述仪器检测方法相比，生物测试方法由于具有效率高速率快、经济等优点，成为环境水样甲状腺激素干扰效应检测的重要技术类型。例如重组TR基因酵母法，其通过将TR和共激活因子的DNA片段分别整合到质粒中，通过生物技术将质粒转染酵母细胞，构建重组TR基因酵母。当酵母细胞暴露到环境水样中，水样TDCs与细胞内的TR作用，激活报道基因LacZ转录产生β
‑
半乳糖苷酶(β
‑
Galactosidase，β
‑
Gal)，通过检测β
‑
Gal活性大小就可以定量表征环境水样的甲状腺激素干扰效应。由于重组TR基因酵母法具有操作简单、反应迅速、方法灵敏等优点成为目前常用的环境水样甲状腺激素干扰效应检测方法。
[0004]但是，传统的重组TR基因酵母法在水环境领域的应用，通常需要结合复杂的样品前处理流程，如水样的富集、净化、浓缩等，极大的削弱了方法在时间、效率方面的优势。此外，传统的方法需要对酵母细胞进行培养，其无菌操作的要求严重制约了该方法在野外的现场应用，因此亟待对方法进行改进以满足现成快速、高效检测的需求。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要提供一种样品处理流程简单、检测条件要求较低的甲状腺激素干扰物的检测方法。
[0006]一种甲状腺激素干扰物的检测方法，包括以下步骤：
[0007]将酵母固定于培养基的表面，所述酵母含有甲状腺激素受体基因、共激活因子基因和报道基因；
[0008]添加待测样本至所述培养基的表面与所述酵母进行作用；
[0009]将与待测样本作用后的所述酵母进行细胞壁破碎；
[0010]检测所述酵母中报道基因的表达水平，所述报道基因的表达水平越高表示所述待测样本中甲状腺激素干扰物的浓度越高。
[0011]本专利技术采用表面固定法将重组TR(甲状腺激素受体)基因酵母固定化，保持酵母特有的生理活性，进而用于与待测样本作用，然后破碎细胞壁并通过检测报道基因的表达水平确定待测样本中甲状腺激素干扰物的浓度。本专利技术建立的固定化酵母环境甲状腺激素干扰效应检测方法可直接将密度较高的酵母细胞固定覆盖在培养基表面，90天的保存期内，
只需直接加入环境样本，就可以开展样品测试，无需水样前处理，无需酵母细胞临时预培养，大大降低了检测条件要求，能够适用于野外的现场检测。测试结果显示该方法保持了酵母细胞活性，新方法体系稳定，结果与现有方法具有可比较性。
[0012]在其中一个实施例中，所述培养基为海藻酸钠培养基或聚乙烯醇培养基。
[0013]在其中一个实施例中，所述海藻酸钠培养基中海藻酸钠的质量浓度为0.01g/mL～0.03g/mL，所述聚乙烯醇培养基中聚乙烯醇的质量浓度为0.005g/mL～0.015g/mL。
[0014]在其中一个实施例中，所述将酵母固定于培养基的表面包括以下步骤：配制OD
600
为0.65～2的酵母菌液，离心去上清后加入20～40μL培养液混合，然后接种于所述培养基的表面。
[0015]在其中一个实施例中，采用裂解液对所述酵母进行细胞壁破碎，所述裂解液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、原钒酸钠、氟化钠和乙二胺四乙酸。
[0016]在其中一个实施例中，所述报道基因为β
‑
半乳糖苷酶基因，通过检测β
‑
半乳糖苷酶的活性检测所述报道基因的表达水平。
[0017]在其中一个实施例中，所述检测β
‑
半乳糖苷酶的活性包括以下步骤：将2
‑
硝基苯基
‑
β
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷与经细胞壁破碎的酵母混合开始酶反应，反应后加入Na2CO3溶液终止酶反应，取上清测定OD值，根据OD值计算β
‑
半乳糖苷酶的活性。
[0018]在其中一个实施例中，所述酶反应的时间为1.5～2.5小时。
[0019]在其中一个实施例中，所述待测样本的体积为400μL～600μL。
[0020]本专利技术还提供了一种甲状腺激素干扰物的检测试剂盒，其包括酵母固定化产物、细胞壁破碎试剂和报道基因检测试剂；所述酵母固定化产物通过将酵母固定于培养基的表面得到，所述酵母含有甲状腺激素受体基因、共激活因子基因和报道基因。
附图说明
[0021]图1为本专利技术实施例1中不同酵母固定化材料的急性毒性表征；
[0022]图2为本专利技术实施例2中不同酵母固定化方式制备的酵母菌密度；
[0023]图3为本专利技术实施例3中不同酵母破碎方式对β
‑
半乳糖苷酶活性测定的影响；
[0024]图4为本专利技术实施例3中不同辅助破碎方式对β
‑
半乳糖苷酶活性测定的影响；
[0025]图5为本专利技术实施例4中不同水样暴露体积对β
‑
半乳糖苷酶活性测定的影响；
[0026]图6为本专利技术实施例5中不同酶反应时间的EC
50
值；
[0027]图7为本专利技术实施例6中固定化酵母检测三碘甲状腺原氨酸的工作曲线。
具体实施方式
[0028]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述，并给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0029]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相
关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0030]本专利技术一实施例的甲状腺激素干扰物的检测方法，其包括以下步骤S1～S4：
[0031]S1、将酵母固定于培养基的表面，酵母含有甲状腺激素受体基因、共激活因子基因和报道基因；
[0032]S2、添加待测样本至培养基的表面与酵母进行作用；
[0033]S3、将与待测样本作用后的酵母进行细胞壁破碎；
[0034]S4、检测酵母中报道基因的表达水平，报道基因的表达水平越高表示待测样本中甲状腺激素干扰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甲状腺激素干扰物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将酵母固定于培养基的表面，所述酵母含有甲状腺激素受体基因、共激活因子基因和报道基因；添加待测样本至所述培养基的表面与所述酵母进行作用；将与待测样本作用后的所述酵母进行细胞壁破碎；检测所述酵母中报道基因的表达水平，所述报道基因的表达水平越高表示所述待测样本中甲状腺激素干扰物的浓度越高。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述培养基为海藻酸钠培养基或聚乙烯醇培养基。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述海藻酸钠培养基中海藻酸钠的质量浓度为0.01g/mL～0.03g/mL，所述聚乙烯醇培养基中聚乙烯醇的质量浓度为0.005g/mL～0.015g/mL。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述将酵母固定于培养基的表面包括以下步骤：配制OD
600
为0.65～2的酵母菌液，离心去上清后加入20～40μL培养液混合，然后接种于所述培养基的表面。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用裂解液对所述酵母进行细胞壁破碎，所述裂解液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、原钒酸钠、氟化...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘芸，易皓，李剑，
申请(专利权)人：北京师范大学，
类型：发明
国别省市：