本发明专利技术公开以Oligo(dT)为亲和配基的层析填料的用途，公开该层析填料在纯化mRNA工艺中的用途，纯化的工艺包括：a.制样；b.上样；c.洗杂；d.洗脱；e.在位清洗。本发明专利技术采用上述填料的纯化方法能实现mRNA的有效捕获、除杂和洗脱，简化后续纯化步骤并最大限度地提高下游纯化整体生产效率，适合工业放大生产。此外，环形RNA序列中如果有Poly(A)结构，该柱层析法也适用。用。用。
【技术实现步骤摘要】
以Oligo(dT)为亲和配基的层析填料的用途
[0001]本专利技术涉及层析填料的用途，特别涉及以Oligo(dT)为亲和配基的层析填料的用途。
技术介绍
[0002]mRNA疫苗在疫苗有效性上遥遥领先传统技术疫苗，这直接促使mRNA技术在疾病预防和治疗领域的快速发展，包括传染病疫苗领域、肿瘤免疫治疗相关领域、单抗药物和其它蛋白类药物替代领域。基于mRNA的疾病预防和治疗，简单来讲就是化学修饰后的mRNA分子进入细胞后，利用细胞自身的蛋白合成机制进行翻译表达，生成疾病预防和治疗所需的目的蛋白。mRNA最大的优势在于其不进入细胞核，不改变基因组，只有瞬时活性，能通过生理代谢降解，因此，mRNA治疗被称为“开启你体内的药厂”。加上mRNA的生产简易、成本低，极大地缩短和降低了新药开发的周期和成本，使得mRNA药物具有很大优势。
[0003]图1所示为mRNA的通式结构，其3
′
端修饰的Poly(A)尾巴对于mRNA的稳定性非常重要，同时，此Poly(A)尾巴为mRNA的纯化提供了有效的途径。将一定长度的寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷(Oligo(dT))键合到固相载体上，可以利用T
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A之间的碱基配对原理捕获修饰有Poly(A)尾巴的mRNA，其它杂质则流穿。然而，mRNA相关行业也是近两年才快速成长起来，如何获得大量可用于临床的mRNA产品依然是一个很大的挑战。
[0004]本专利技术采用赛分科技研发生产的基于Oligo(dT)的亲和填料，开发了一套用于纯化mRNA的柱层析法工艺，在简化纯化步骤的同时，避免了使用有毒试剂，提高了纯度和收率，可用于mRNA产品的放大生产。
[0005]此外，环形RNA(circular RNA，endless RNA，eRNA)近年来受到了越来越多的关注，相比于mRNA，环形RNA具有稳定性好和制备简单的优势。环形RNA在制备过程中可省去加帽、加尾和修饰这三个步骤，操作上相对更容易。如果在设计环形RNA时，在碱基序列中加入Poly(A)结构，同样可以使用Oligo(dT)的亲和填料进行纯化。
技术实现思路
[0006]mRNA疫苗在疫苗有效性上遥遥领先传统技术疫苗，这直接促使mRNA技术在疾病预防和治疗领域的快速发展，包括传染病疫苗领域、肿瘤免疫治疗相关领域、单抗药物和其它蛋白类药物替代领域。基于mRNA的疾病预防和治疗，简单来讲就是化学修饰后的mRNA分子进入细胞后，利用细胞自身的蛋白合成机制进行翻译表达，生成疾病预防和治疗所需的目的蛋白。mRNA最大的优势在于其不进入细胞核，不改变基因组，只有瞬时活性，能通过生理代谢降解，因此，mRNA治疗被称为“开启你体内的药厂”。加上mRNA的生产简易、成本低，极大地缩短和降低了新药开发的周期和成本，使得mRNA药物具有很大优势。
[0007]图1所示为mRNA的通式结构，其3
′
端修饰的Poly(A)尾巴对于mRNA的稳定性非常重要，同时，此Poly(A)尾巴为mRNA的纯化提供了有效的途径。将一定长度的寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷(Oligo(dT))键合到固相载体上，可以利用T
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A之间的碱基配对原理捕获修饰有Poly
(A)尾巴的mRNA，其它杂质则流穿。然而，mRNA相关行业也是近两年才快速成长起来，如何获得大量可用于临床的mRNA产品依然是一个很大的挑战。
[0008]本专利技术采用赛分科技研发生产的基于Oligo(dT)的亲和填料，开发了一套用于纯化mRNA的柱层析法工艺，在简化纯化步骤的同时，避免了使用有毒试剂，提高了纯度和收率，可用于mRNA产品的放大生产。
[0009]此外，环形RNA(circular RNA，endless RNA，eRNA)近年来受到了越来越多的关注，相比于mRNA，环形RNA具有稳定性好和制备简单的优势。环形RNA在制备过程中可省去加帽、加尾和修饰这三个步骤，操作上相对更容易。如果在设计环形RNA时，在碱基序列中加入Poly(A)结构，同样可以使用Oligo(dT)的亲和填料进行纯化。
附图说明
[0010]图1为mRNA结构通式；
[0011]图2为采用实施例1的纯化方法对mRNA分离纯化图谱；
[0012]图3为采用实施例1的纯化方法对mRNA分离分析检测图谱；
[0013]图4为采用实施例2的纯化方法对mRNA分离纯化图谱；
[0014]图5为采用实施例2的纯化方法对mRNA分离分析检测图谱；
[0015]图6为采用实施例7的纯化方法对mRNA分离纯化图谱；
[0016]图7为采用实施例7的纯化方法对mRNA分离分析检测图谱；
[0017]图8为采用实施例8的mRNA特异性结合实验；
[0018]图9为采用实施例9的mRNA特异性结合实验。
具体实施方式
[0019]实施例1
[0020]本实施例采用赛分科技研发生产的Monomix dT20亲和填料1mL预装柱(填料规格为30m，预装柱货号为283030950
‑
70025)，上样样品为2.0mg的mRNA(约1000nt，浓度0.2mg/mL)；平衡缓冲液为100mM Tris+500mM NaCl，pH 7.5；线性流速为87cm/h；CIP：0.1M NaOH的水溶液。
[0021]纯化过程：以缓冲液平衡层析柱；提前将层析柱置于柱温箱中预热到50℃，2mg的mRNA溶解于含有500mM NaCl的制样缓冲液中(1∶3体积比混合)，上样。以缓冲液20mM Tris+200mM NaCl，pH 7.5冲洗柱子，线性流速为87cm/h；提前将层析柱置于柱温箱中预热到65℃，在260nm紫外光下，以洗脱液10mM Tris，pH 7.5洗脱样品，并记录其峰面积；然后以CIP缓冲液(0.1M NaOH的水溶液)冲洗柱子，如图2。使用完色谱柱后，将其保存在20％乙醇水溶液中，4℃条件保存。检测所用的分析柱SRT SEC
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1000，5μm，7.8x300mm(PN：215950
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7830)由苏州赛分科技有限公司提供，检测结果如图3。
[0022]实验结果表明，Monomix dT20层析柱采用此纯化方法具有如下特点：
[0023]1)可以在50℃条件下，通过Oligo(dT)捕获带有Poly(A)尾巴的mRNA，通过提高温度，破坏Poly(A)尾巴与Oligo(dT)的亲和结合，达到了分离mRNA的效果。
[0024]2)使用此纯化方法，mRNA的回收率＞75％，其纯度＞95％。
[0025]3)以0.1M NaOH水溶液作为CIP的溶液，对色谱柱进行消毒和再生，以进行下一轮
纯化。
[0026]表1mRNA纯化分离操作条件
[0027][0028][0029]实施例2
[0030]本实施例采用赛分科技研发生产的Monomix dT20亲和填本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种以Oligo(dT)为亲和配基的层析填料在纯化mRNA工艺中的用途。2.根根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述层析填料结构如下：SP
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R
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Oligo dT其中，SP为基础介质，Oligo(dT)为亲和配基，R为基础介质偶联Oligo(dT)的间隔臂。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述基础介质为琼脂糖微球、聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯
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二乙烯基苯微球或硅胶微球中的一种；所述Oligo dT为具有10到30个碱基的多聚脱氧胸腺嘧啶，且在5
’
端修饰有氨基；所述间隔臂R的两端都具有环氧基、一端与介质偶联，另一端与Oligo(dT)末端的氨基偶联，中间具有任意化学结构。4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述层析填料的制备方法包括：(1)将基础介质活化，得到表面修饰有大量环氧基或醛基的活化介质；(2)将Oligo(dT)偶联至活化介质上；(3)将多余醛基或环氧基封闭处理，得到Oligo dT亲和介质。5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：纯化mRNA工艺包括：a.制样，有两种方法：法a1，将mRNA溶解于制样缓冲液中；a2，将mRNA溶解于制样缓冲液中，加热，然后立即在冰上冷却；b.上样，有两种方法：b1，用柱温箱加热层析柱，随后上样，b2，mRNA在室温下上样；c.洗杂：使用高盐洗涤缓冲液洗去杂质；d.洗脱，有两种方法：d1，加热层析柱，破坏mRNA中Poly(A)尾巴与层析介质表面上Oligo(dT)碱基之间的氢键；d2，低盐缓冲液或水破坏mRNA中Poly(A)尾巴与层析介质表面上Oligo(dT)碱基之间的氢键；e.在位清洗：对色谱柱进行消毒并再生色谱柱，以进行下一轮纯化。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：mRNA带有Poly(A)尾巴，Poly(A)尾巴可以通过DNA质粒翻译形成或者通过加尾酶添加；所述纯化方法的mRNA长度≥500nt，或≥750nt...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕小林，齐甜铭，丁良龙，胡新妹，毛慧明，
申请(专利权)人：苏州赛分科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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