一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，包括以下步骤：构建双荧光素酶报告载体pVSP1

【技术实现步骤摘要】
一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法。

技术介绍

[0002]植物激素茉莉素在调控植物防御中发挥十分关键的作用。茉莉素合成或信号转导突变体对许多植物病原菌和昆虫的抗性显著低于野生型。已有研究表明，通过分泌效应蛋白进入植物细胞从而抑制植物茉莉素途径可能是病原菌和昆虫普遍采用的一种入侵策略。因此，通过筛选能够抑制茉莉素途径的病原菌或昆虫效应蛋白，可揭示病原菌或昆虫入侵的关键致病因子，为通过RNAi等方法进行病原菌或昆虫防治提供了靶点基因，具有重要的科学意义和实际应用价值。但以往主要通过构建转基因植物或者转基因菌株来研究病原菌或昆虫效应因子对植物茉莉素信号途径的影响。然而，此种方法耗时耗力，难以进行效应因子的大规模筛选。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的在于提供一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，本专利技术方法可以用简单快速的操作过程和低成本的仪器实现高效率、大批量的筛选抑制茉莉素途径的病原效应因子。
[0004]本专利技术提供的技术方案如下：
[0005]一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，包括以下步骤：
[0006]1)构建双荧光素酶报告载体pVSP1
‑
DL，并转入农杆菌中；
[0007]2)将待筛选的效应因子基因片段构建到p35S超表达载体，并转入农杆菌中；
[0008]3)将含有报告载体的农杆菌与含有效应因子超表达载体的农杆菌混合，并注射烟草叶片；
[0009]4)使用LUC荧光素酶的底物喷施注射的烟草叶片，进行荧光成像；
[0010]5)对烟草注射部位取样，进行LUC和REN双荧光素酶酶活测定。
[0011]进一步的，若烟草注射部位的LUC与REN酶活的比值显著低于注射报告载体与植物双元超表达载体p35S混合菌液的叶片区域，则待筛选的效应因子具有抑制植物茉莉素途径的功能。
[0012]进一步的，步骤1)中，构建得到的双荧光素酶报告载体中含有如下元件：茉莉素标志基因VSP1的启动子驱动的萤火虫荧光素酶基因(LUC)，用于指示植物内源茉莉素途径激活水平；组成型启动子35S驱动的海肾荧光素酶基因(REN)，用作内参，用于平衡不同样品间农杆菌表达效率不同造成的误差。
[0013]进一步的，步骤2)中，待筛选的效应因子基因为来源于微生物(包括病毒、细菌、真
菌、卵菌等)或昆虫的分泌蛋白编码基因。
[0014]进一步的，步骤3)中，含有效应因子超表达载体的农杆菌需与含有报告载体的农杆菌混合后，再进行烟草注射。
[0015]进一步的，步骤4)中，注射农杆菌的烟草叶片在2
‑
8天后喷施荧光素酶底物进行荧光成像。
[0016]进一步的，步骤5)中，取样部位为注射了农杆菌的烟草叶片区域，取样时间为注射后2
‑
8天。
[0017]在所述构建双荧光素酶报告载体pVSP1
‑
DL中，萤火虫荧光素酶基因(LUC)的表达受茉莉素标志基因VSP1的启动子驱动，用于指示植物内源茉莉素途径激活水平；海肾荧光素酶(REN)的表达受组成型启动子35S驱动，作为内参，用于平衡不同样品间农杆菌表达效率不同造成的误差。报告载体pVSP1
‑
DL的构建构建过程如附图1所示：以拟南芥基因组DNA为模板，使用PCR的方法扩增VSP1启动子，然后将其连入pZhou载体，获得pVSP1
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LUC载体；使用PCR的方法，以pGreenⅡ0800
‑
LUC载体为模板，扩增REN基因表达盒，然后连入pVSP1
‑
LUC载体，获得pVSP1
‑
DL报告载体。载体GreenⅡ0800
‑
LUC在文献“Hellens et al.,2005.Transient expression vectors for functional genomics,quantification of promoter activity and RNA silencing in plants.Plant Methods,1:13”中公开过。载体pZhou在文献“Yu et al.,2012,A mutation in the E2 subunit of the mitochondrial pyruvate dehydrogenase complex in Arabidopsis reduces plant organ size and enhances the accumulation of amino acids and intermediate products of the TCA Cycle.Planta,236:387
–
399”中公开过。
[0018]在将含有报告载体的农杆菌与含有效应因子超表达载体的农杆菌混合中，含有报告载体的农杆菌终浓度为OD
600
＝0.2，含有效应因子超表达载体的农杆菌终浓度为OD
600
＝0.4；调整农杆菌浓度所用缓冲液组成成分为：10mM MES，10mM MgCl2,0.2mM乙酰丁香酮。使用的农杆菌菌株为GV3101，可从商业途径获得。
[0019]进一步的，在所述的使用荧光素酶底物喷施注射的烟草叶片中，喷施时间为注射后48小时；荧光素酶底物的组成成分为：150μg/mL D
‑
Luciferin，0.1％Tritonx
‑
100。此底物可被LUC荧光素酶催化产生荧光，而不能被REN荧光素酶催化。
[0020]进一步的，在所述的荧光成像中，所用仪器为Tanon 5200 Chemiluminescent Imaging System。
[0021]进一步的，在所述的对烟草注射部位取样中，取样方法为使用打孔器，将农杆菌注射范围内的烟草叶片取下，而不包含未注射农杆菌的区域。
[0022]进一步的，在所述的进行双荧光素酶测定中，样品按照Dual
‑
Luciferase Reporter Assay System(Promega)试剂盒说明书进行提取和测定，测定所用仪器为Glomax multi+(Promega)。
[0023]进一步的，将含有报告载体的农杆菌、含有效应因子超表达载体的农杆菌和p35S空载体的农杆菌分别划线活化后，挑单克隆于LB培养基中培养，离心收集菌体，去除培养基上清，所述LB培养基含有50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素。
[0024]本专利技术还提供上述方法在在病原微生物或昆虫防治中的应用。
[0025]有益效果
[0026]本专利技术中，我们创建了一套基于烟草瞬时表达系统的效应因子筛选体系。在这一体系中，我们使用茉莉素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：构建双荧光素酶报告载体pVSP1
‑
DL，并转入农杆菌中；将待筛选的效应因子基因片段构建到植物双元超表达载体，并转入农杆菌中；将含有报告载体的农杆菌与含有效应因子超表达载体的农杆菌混合，并注射烟草叶片；使用LUC荧光素酶的底物喷施注射的烟草叶片，进行荧光成像；对烟草注射部位取样，进行LUC和REN双荧光素酶酶活测定。2.根据权利要求1所述的高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，若烟草注射部位的LUC与REN酶活的比值显著低于注射报告载体与植物双元超表达载体p35S混合菌液的叶片区域的酶活的比值，则待筛选的效应因子具有抑制植物茉莉素途径的功能。3.根据权利要求1所述高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，构建得到的双荧光素酶报告载体中含有如下元件：茉莉素标志基因VSP1的启动子驱动的萤火虫荧光素酶基因，用于指示植物内源茉莉素途径激活水平；组成型启动子35S驱动的海肾荧光素酶基因，用作内参，用于平衡不同样品间农杆菌表达效率不同造成的误差。4.根据权利要求1所述高效筛选具有植物茉莉素途径抑制功能的病原效应因子的方法，其特征在于，待筛选的效应因子基因为来源于微生物或昆虫的分泌蛋白编码基因。5.根据权利要求1所述高效筛选具有植物...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴德伟，王幼平，杨文文，樊红霞，聂甲玥，吴健，孙勤富，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：