一种稳定的液体检测试剂盒制造技术

本申请公开了一种稳定的液体检测试剂盒。本申请的试剂盒包含酰基化的NAD变体/酰基化的NADP变体作为氢供体。由于在传统的酶检测系统中引入了改进的氢供体，使试剂稳定性明显提升。升。

【技术实现步骤摘要】
一种稳定的液体检测试剂盒
[0001]本申请要求2021年03月02日提交的中国专利申请(申请号2021102296772)的优先权。


[0002]本申请涉及生物化学、临床检验领域。具体而言，涉及一种改进的酶法检测方法、改进的液体检测试剂、经修饰的辅酶及其用途。

技术介绍

[0003]在临检领域，用还原型烟酰胺辅酶(NADH或NADPH)检测样本中的待测物是一个广泛使用的方法。试剂中NADH或NADPH的氧化程度，与样本中待测物的浓度/含量成比例。根据样本中待测物的不同，采用作用于该待测物的相应酶，经过酶与底物一步或多步反应，直接或间接使得试剂中的NADH或NADPH被氧化，反应物中吸光度发生变化，通过测量吸光度的变化，可计算出样本中待测物的浓度。
[0004]1)比如，在肌酐的检测中，血清中内源性NH3在谷氨酸脱氢酶催化及NADH/NADPH供氢的条件下，与α
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酮戊二酸反应生成谷氨酸，清除内源性NH3：
[0005][0006]样本中的肌酐经肌酐亚胺基水解酶水解，生成1
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甲脲乙醇酸酐和NH3；再经过谷氨酸脱氢酶催化α
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酮戊二酸和NH3，在NADH/NADPH供氢的条件下生成谷氨酸，然后测定340nm处NADH/NADPH吸光度降低速率计算肌酐含量：
[0007][0008][0009]2)例如，血浆样本中氨浓度的检测，血浆中的氨在谷氨酸脱氨酶作用下与α
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酮戊二酸反应生成谷氨酸盐，同时NADH或NADPH被氧化为NAD+或NADP+，反应系统在340nm处的吸光度值下降，通过检测340nm处吸光度的下降值。就可以算出样本中氨的浓度。
[0010]3)再例如，血清样本中丙氨酸氨基转移酶浓度的检测，样本中丙氨酸氨基转移酶催化丙氨酸氨基转换至α
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氧代戊二酸，生成丙酮酸和L
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谷氨酸；生成的丙酮酸被试剂中的脱氢酶还原为L
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乳酸，同时NADH或NADPH被氧化为NAD+或NADP+，反应系统在340nm处的吸光度值下降。通过检测340nm处吸光度的下降值，就可以计算出样本中丙氨酸氨基转移酶的浓度。
[0011]然而，NADH或NADPH通常在试剂中并不稳定，尤其是偏酸/中性的缓冲液环境中。因此，现有技术中可见以下策略来稳定NADH或NADPH：
[0012]1)制备成干粉试剂，通过保持试剂的干燥状态，保持NADH或NADPH的稳定。
[0013]2)调整NADH或NADPH所处试剂的pH值，使pH在9.0至11.5的范围；但是较高的pH会使酶的活性降低。
[0014]3)Joseph De Giorgio等专利技术了在检测试剂中加入NADH或NADPH的再生系统，如葡萄糖
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磷酸脱氢酶和葡萄糖，将试剂保存过程中NADH或NADPH，被氧化生成的NAD或NADP再缓慢还原为NADH或NADPH，从而保持检测试剂中有效的NADH或NADPH浓度。
[0015]4)Richard A Kaufman利用葡萄糖
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磷酸脱氢酶及葡萄糖
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磷酸，在试剂检测过程中原位快速再生还原型辅酶，其再生速率需要大于待测物酶系统再氧化的速率。然而，实际上待测物的检测是在还原型辅酶再生的同时或以后进行的，试剂中葡萄糖
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磷酸的浓度低于用于再生还原型辅酶的氧化型辅酶的摩尔浓度，因此检测试剂配制成单一液体试剂后，再生的NADH或NADPH与普通检测试剂中一样不稳定。
[0016]5)US5278044提供了一种用脂质体来稳定还原型辅酶的方法，然而这个策略不适用于诊断试剂领域。
[0017]6)US5278044提供了用碳酸盐
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碳酸氢盐缓冲体系来稳定NADH的方法，该方法的最佳pH值为10.0
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10.4，这个范围的pH过高，使得很多酶在该pH范围的活性受到影响。
[0018]7)CN101140279A和CN1311335A向试剂中添加螯合剂来稳定还原型辅酶，然而金属离子螯合剂使得酶的活性受影响。
[0019]综上，仍有必要提供一种稳定性好的还原型辅酶，可与酶混合，用于临床生化的液体型试剂中。

技术实现思路

[0020]鉴于上述本领域的需求，提供了一种还原型辅酶试剂，其包含：
[0021]‑
还原型辅酶、
[0022]‑
缓冲液、
[0023]‑
任选地，氧化还原酶，其能够接受来自还原型辅酶的供氢。
[0024]在一个实施方案中，所述还原型辅酶试剂不是干粉制剂。
[0025]在一个实施方案中，所述缓冲液选自：Tris
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HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸
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柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑缓冲液、CAPSO缓冲液、Tricine缓冲液。
[0026]在所有实施方案中，所述还原型辅酶不是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。
[0027]在所有实施方案中，所述还原型辅酶不是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。
[0028]在一个实施方案中，所述还原型辅酶是酰基化NADH或其盐。
[0029]在一个实施方案中，所述还原型辅酶是酰基化NADPH或其盐。
[0030]在一个实施方案中，所述还原型辅酶是3
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乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸或其盐，如3
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乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸二钠盐：
[0031][0032]在一个实施方案中，所述还原型辅酶是3
‑
乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐，如3
‑
乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸四钠盐：
[0033][0034]在一个实施方案中，所述酰基化NADH或其盐在还原型辅酶试剂中的浓度为0.05至10.0g/L；例如0.1至1.0g/L。具体地，所述酰基化NADH或其盐在还原型辅酶试剂中的浓度为0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0g/L；前述任意两个数值之间的任何整数和小数视为在本申请中被明确地提及。或者，所述酰基化NADH或其盐在还原型辅酶试剂中的浓度为0.1mmol/L至50mmol/L。
[0035]在一个实施方案中，所述酰基化NADPH或其盐的浓度为0.05至10.0g/L，优选为0.1至1.0g/L。所述酰基化NADPH或其盐在还原型辅酶试剂中的浓度为0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种还原型辅酶试剂，其包含：
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还原型辅酶、
‑
缓冲液、
‑
任选地，氧化还原酶；其中：所述还原型辅酶试剂不是干粉制剂；所述缓冲液选自以下任一项或其组合：Tris
‑
HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸
‑
柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑缓冲液、CAPSO缓冲液、Tricine缓冲液；所述氧化还原酶是指可以接受还原型辅酶供氢的酶；所述还原型辅酶不是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)；所述还原型辅酶不是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)；所述还原型辅酶是酰基化NADH或其盐、或酰基化NADPH或其盐；优选地，所述还原型辅酶是3
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乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸或其盐；优选地，所述还原型辅酶是3
‑
乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐；优选地，所述盐选自以下任一项：钠盐、钾盐、钙盐、镁盐。2.根据权利要求1所述的还原型辅酶试剂，其中：还原型辅酶的浓度为0.05g/L至10.0g/L，优选为0.1g/L至1.0g/L。3.根据权利要求1或2所述的还原型辅酶试剂，其pH不大于9；优选pH为7至9。4.根据权利要求1至3中任一项所述的还原型辅酶试剂，其还包含选自以下任一组的再生底物和再生底物酶：i)葡萄糖和葡萄糖脱氢酶；ii)异柠檬酸盐和异柠檬酸脱氢酶；iii)乳酸盐和乳酸脱氢酶；iv)甘油和甘油脱氢酶；v)葡萄糖6磷酸和葡萄糖6磷酸脱氢酶；vi)半乳糖和半乳糖脱氢酶。5.根据权利要求1至4中任一项所述的还原型辅酶试剂，其还包含选自以下任一项或其组合：稳定剂、表面活性剂、防腐剂；优选地，所述稳定剂选自以下任一项或其组合：乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、甘油、乙二醇、巯基乙醇、二硫苏糖醇；优选地，所述表面活性剂选自以下任一项或其组合：Brij35、Thesit、Tween20、Tween80、AEO、Triton X；优选地，所述防腐剂选自以下任一项或其组合：叠氮钠、叠氮锂、ProClin300。6.还原型辅酶在制备检测试剂中的用途，其中所述还原型辅酶是酰基化NADH或其盐、或酰基化NADPH或其盐；
优选地，所述还原型辅酶是3
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乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸或其盐；优选地，所述还原型辅酶是3
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乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐；优选地，所述盐选自以下任一项：钠盐、钾盐、钙盐、镁盐；所述检测试剂是指以还原型辅酶作为氢供体的检测试剂；所述检测试剂是单试剂或多试剂；优选地，所述检测试剂选自以下的任一项：肌酐检测试剂、同型半胱氨酸检测试剂、总胆汁酸检测试剂、二氧化碳或碳酸氢根检测试剂、尿素检测试剂、半乳糖检测试剂、甘氨酸检测试剂、无机磷检测试剂、镁离子检测试剂、钾离子检测试剂、钙离子检测试剂、总胆固醇检测试剂、甘油三酯检测试剂、血氨检测试剂、涂唾液酸检测试剂、单胺氧化酶检测试剂、5
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核苷酸酶检测试剂、腺...

【专利技术属性】
技术研发人员：王欢，宋占科，蔡华雅，刘希，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：