不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较法制造技术

本发明专利技术公开了一种不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较方法，包括以下步骤：将作为待测样品的三叶青叶片洗净并晾干，得洗涤后三叶青叶片；将洗涤后三叶青叶片、提取剂、小钢珠放置于离心管内进行震荡，从而将叶片磨碎；再于超声水浴锅内进行超声处理和保温，离心后收集上清液；将1.5ml上清液，与5ml DMACA试剂溶液混合后在室温下避光保持一定时间，作为待测样品液；使用分光光度计，测定待测样品液在波长643nm处的吸光度值(A

【技术实现步骤摘要】
不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较法


[0001]本专利技术属于植物有效成分提取
，具体涉及一种快速检测不同含量原花青素三叶青叶片种源筛选的方法及应用。

技术介绍

[0002]三叶青(Tetrastigmatis hemsleyani)，又名三叶崖爬藤、金线吊葫芦、三叶扁藤、蛇附子、三叶对、石猴子等，为葡萄科三叶崖爬藤属多年生常绿藤本植物，是我国特有的珍稀药用植物，全草皆可入药，尤其以块根和果实的药用效果最好，多晒干或鲜用，是我国民间珍稀中草药，也是目前治疗癌症较为有效的药用植物。三叶青主要分布在长江以南地区，生于阴湿山坡、山沟或溪谷旁林下，以块根或全草人药，为民间常用的中草药。
[0003]三叶青也是目前治疗癌症较为有效的药用植物。药理研究表明，三叶青无毒无害，具有抗肿瘤、保肝、抗病毒、抗炎、调节免疫等作用。目前三叶青被用于抗肿瘤、抗风湿、制肝炎等类型的中成药生产，如三叶青颗粒、金芪片、金丝地甲胶囊、华佗风湿宝胶囊等。临床上已广泛用于抗癌及抗艾滋病毒、抗肿瘤、治疗血液病与心脑血管疾病、肝炎、脑膜炎、急性支气管炎、肺炎、肠炎及咽喉炎、小儿外感高热等疾病。
[0004]原花青素是黄烷
‑3‑
醇类化合物，由不同数量的儿茶素、表儿茶素或没食子酸经C4—C6或C4—C8键缩合而成。原花青素属于植物源类黄酮，为多酚类物质。原花青素的有益作用包括抗氧化、抗菌、抗炎、保护牙周，延缓衰老。对人类癌细胞具有很好的抑制作用，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、口腔鳞细胞癌和胃癌或抑制炎症因子的表达等。因为不同产地的三叶青品种所含的原花青素差异很大，因此快速检测不同地域的三叶青品种原花青素含量的差异性，有利于筛选到特有的富含原花青素的三叶青品种，从而有利于进一步挖掘三叶青的药用价值和基因定位。另有研究表明，三叶青不同部位原花青素的末端单元以儿茶素为主，延伸单元以表儿茶素和表没食子儿茶素为主。
[0005]目前，未见有利用化学染色法和紫外分光光度计来测定三叶青原花青素含量的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较方法，以解决现有技术中不同含量原花青素三叶青叶片种源筛选的问题。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较方法，包括以下步骤：
[0008]1)、将作为待测样品的三叶青叶片(新鲜三叶青叶片)洗净并晾干(晾干至叶片表面无水渍)，得洗涤后三叶青叶片；
[0009]2)、称取0.1g洗涤后三叶青叶片，放置于离心管(5ml离心管)中，加入4
±
0.1mL提取剂，然后在离心管内放入5mm小钢珠1颗，密封离心管的管盖后，放置于震荡仪中，以5m/s的速度，震荡80
±
5s，从而将叶片磨碎；
[0010]所述提取剂为含0.1％(w/v)抗坏血酸的甲醇溶液，即，在100ml甲醇中加入0.1g的抗坏血酸；
[0011]3)、将步骤2)震荡处理结束后的离心管放置于超声水浴锅内，于65
±
2℃温度下超声20
±
1min，接着再于65
±
2℃水浴保温30
±
1min，离心后收集上清液(并记录上清液体积V1)；
[0012]4)、将1.5ml上清液，与5ml DMACA试剂溶液混合后在室温下避光保持20
±
1分钟，作为待测样品液(备用)；
[0013]5)、使用分光光度计，测定待测样品液在波长643nm处的吸光度值(A
643
)，吸光度值(A
643
)高的待测样品，其原花青素含量高。
[0014]作为本专利技术的不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较方法的改进：
[0015]所述DMACA试剂溶液的制备方法为：将甲醇与浓度为6mol/L的HCl水溶液按照1:1的体积比混合，得混合溶剂，在1L混合溶剂中加入2g的4
‑
二甲基氨基肉桂醛(DMACA)均匀搅拌。
[0016]作为本专利技术的不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较方法的进一步改进：步骤3)的离心为：以5000
±
500g离心5
±
0.5分钟。
[0017]作为本专利技术的不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较方法的进一步改进，还包括以下步骤：
[0018]6.1)、获得吸光度值(A
643
)与原花青素浓度关联的标准曲线；
[0019]6.2)、将步骤5)所得的吸光度值(A
643
)带入步骤6.1)所得的标准曲线，获得上清液中原花青素的质量浓度C，再经换算，得待测样品的三叶青叶片中原花青素的含量。
[0020]作为本专利技术的不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较方法的进一步改进：
[0021]所述步骤6.2)按照如下换算公式获得三叶青叶片样品中原花青素的含量；
[0022]换算公式：
[0023]原花青素含量＝CV1/m；
[0024]式中：C为上清液中原花青素测得质量浓度；V1为上清液体积；m为取三叶青叶片的质量。
[0025]作为本专利技术的不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较方法的进一步改进，步骤6.1)为：
[0026]首先分别取0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mg的原花青素标准品至10mL容量瓶，加甲醇配制成浓度为0.0，0.005，0.010，0.020，0.050，0.100，0.200mg/mL溶液；然后将上述7个浓度的原花青素标准样品溶液，按照DMACA试剂溶液/原花青素样品溶液＝10:3的体积比，分别取1.5mL原花青素标准样品溶液，与5mL ADMACA试剂溶液混合后在室温下避光保持20
±
1分钟，制成标准溶液；
[0027]利用紫外分光光度计，测定标准溶液在波长643nm处的吸光度值(A
643
)，而后绘制标准曲线并建立回归方程。
[0028]本专利技术是一种快速筛选不同含量原花青素三叶青叶片种源的方法；本专利技术的方法具有使用试剂价格低廉、操作简单、效率高，能有效筛选获得原花青素高的三叶青叶片种源
的优势。
附图说明
[0029]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。
[0030]图1为原花青素的标准曲线；
[0031]图2为标准溶液的光谱扫描；
[0032]图3为两种三叶青叶片样品原花青素含量比较。
具体实施方式
[0033]下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：
[0034]实验仪器：
[0035]本实施例所用的紫外分光广度计(UV
‑
2550，岛津公司)；离心机(58本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较方法，其特征在于包括以下步骤：1)、将作为待测样品的三叶青叶片洗净并晾干，得洗涤后三叶青叶片；2)、称取0.1g洗涤后三叶青叶片，放置于离心管中，加入4
±
0.1mL提取剂，然后在离心管内放入5mm小钢珠1颗，密封离心管的管盖后，放置于震荡仪中，以5m/s的速度，震荡80
±
5s，从而将叶片磨碎；所述提取剂为含0.1％(w/v)抗坏血酸的甲醇溶液；3)、将步骤2)震荡处理结束后的离心管放置于超声水浴锅内，于65
±
2℃温度下超声20
±
1min，接着再于65
±
2℃水浴保温30
±
1min，离心后收集上清液；4)、将1.5ml上清液，与5ml DMACA试剂溶液混合后在室温下避光保持20
±
1分钟，作为待测样品液；5)、使用分光光度计，测定待测样品液在波长643nm处的吸光度值(A
643
)，吸光度值(A
643
)高的待测样品，其原花青素含量高。2.根据权利要求1所述的不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较方法，其特征在于：所述DMACA试剂溶液的制备方法为：将甲醇与浓度为6mol/L的HCl水溶液按照1:1的体积比混合，得混合溶剂，在1L混合溶剂中加入2g的4
‑
二甲基氨基肉桂醛均匀搅拌。3.根据权利要求2所述的不同种源的三叶青叶片中原花青素含量高低的快速比较方法，其特征在于，所述步骤3)的离心为：以5000

【专利技术属性】
技术研发人员：任晓旭，岳二魁，严建立，王贤波，陆秋君，阮松林，钱丽华，黄雨晴，应武，
申请(专利权)人：杭州市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：