一种人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法技术

本发明专利技术公开了一种人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法，包括以下步骤：1)配制缓冲体系，对样本进行孵育，所述缓冲体系中包含血管紧张素转化酶抑制剂；2)向孵育后的样本中加入内标液和蛋白沉淀剂，对样本进行前处理；3)取经过前处理后的上清液，采用液相色谱质谱联用仪进行检测，采用内标法，结合色谱系统和质谱系统，将进样样品中的物质分离并对血管紧张素I进行定量及定性检测；4)计算单位时间内单位体积的样本中的血管紧张素I的生成速率。本方法的前处理操作简单，无需固相萃取，无需氮吹复溶，且本发明专利技术方法采用液相色谱分离定量，检测速度快，同时保证了检测的灵敏度和可靠性，有利于临床样本的高通量筛查。有利于临床样本的高通量筛查。有利于临床样本的高通量筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法


[0001]本专利技术涉及医学检测
，具体涉及一种人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法。

技术介绍

[0002]肾素是由肾小球旁细胞产生、贮存、分泌的一种蛋白水解酶。肾素能将血管紧张素原转变为血管紧张素I，血管紧张素I又在血管紧张素转化酶的作用下转化为具有生物活性的血管紧张素II。血管紧张素II是一种有效的升压剂，在调节血压方面发挥着重要作用，同时还作用于肾上腺皮质球状带刺激醛固酮的合成。
[0003]血浆中内源性肾素催化血管紧张素原产生血管紧张素Ⅰ的速率被称为血浆肾素活性(PRA)。中国及其他很多国家的原发性醛固酮增多症诊疗专家共识或内分泌高血压筛查指南，都将血浆醛固酮与肾素活性的比值作为原发性醛固酮增多症的筛查指标。原发性醛固酮增多症是一种最常见的内分泌高血压，且很容易被人们忽视。至少有5％～10％的高血压患者存在原发性醛固酮增多症，在难治性高血压人群中，原发性醛固酮增多症的患病率约为20％，而且，不到25％的原发性醛固酮增多症患者有低血钾，这些患者与其他原发性高血压患者很难区分，除非进行肾素活性和醛固酮的检测。
[0004]目前，常见的血浆中肾素活性检测方法主要有放射免疫法(RIA)、化学发光免疫法(CLIA)和液相色谱串联质谱法(LC
‑
MS/MS)。放射免疫法和化学发光免疫法的步骤复杂、耗时，重复性差且有非特异性结合。近年来随着液相色谱串联质谱的普及和质谱法本身具有极高的准确度和灵敏度的优势，目前已有多种应用液相色谱串联质谱检测肾素活性的方法。现有技术中，利用液相色谱串联质谱检测肾素活性的方法分别为：1)、利用在线固相萃取对孵化后产生的AngI进行分离提取，然后经C18色谱柱分离后进入质谱进行检测，但是该方法需要额外配置在线固相萃取装置；2)、利用非在线96孔固相萃取板，该方法虽然无需配置额外在线固相萃取装置，但是仍然需要消耗价格较高的固相萃取板；3)利用有机溶剂进行蛋白沉淀，对样品进行前处理，该方法无需利用固相萃取，仅需要简单的有机溶剂进行蛋白沉淀即可，但是该方法仍需要约3～4小时的氮吹，然后进行复溶，比较耗费时间。
[0005]因此，在利用液相色谱质谱联用检测方法对人血浆肾素活性进行检测领域内，需要建立一种操作简单、成本可控、准确可靠、灵敏度高而且高效快速的检测方法。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法，针对其他方法检测过程繁琐、耗时的缺点进行了改进和优化，提供了一种简单快速，无需固相萃取，无需氮吹复溶的前处理方法，并且液相色谱分离时间更短。该方法节省了时间，同时保证了检测的灵敏度和可靠性，从而使之更加有利于临床样本的高通量筛查。本方法包括以下步骤：
[0007]1)配制缓冲体系，对样本进行孵育，所述缓冲体系中包含血管紧张素转化酶抑制
剂；
[0008]2)向孵育后的样本中加入内标液和蛋白沉淀剂，对样本进行前处理；
[0009]3)取经过前处理后的上清液，采用液相色谱质谱联用仪进行检测，采用内标法，结合色谱系统和质谱系统，将进样样品中的物质分离并对血管紧张素I进行定量及定性检测；
[0010]4)计算单位时间内单位体积的样本中的血管紧张素I的生成速率。
[0011]具体地，步骤1)中所述样本包括校正样本、质控样本和病人样本，所述孵育是指将孵化液和样本按照2:3的比例混合后，置于96孔板中进行孵化。
[0012]具体地，所述孵化为在37℃条件下水浴孵化1.5
‑
5小时。
[0013]优选地，所述孵化时间为3小时。
[0014]具体地，步骤2)中，所述内标液为血管紧张素I内标溶液，所述血管紧张素I内标溶液的浓度为10
‑
200ng/mL；所述蛋白沉淀剂包括有机溶剂、金属盐或强酸。
[0015]优选地，所述蛋白沉淀剂为含有甲酸的乙腈或含有甲酸的甲醇，所述甲酸的含量为0.1％
‑
10％。
[0016]具体地，步骤1)中，所述样本的体积为50
‑
500μL。
[0017]具体地，步骤3)中，所述液相色谱质谱联用仪的色谱条件为：
[0018]色谱柱为反相柱，进样体积为0.5
‑
50μL；柱温为25
‑
60℃；流速为0.3
‑
2mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；流动相A为甲酸水溶液，流动相B为含有甲酸的甲醇液或含有甲酸的乙腈液。
[0019]具体地，所述流动相A和流动相B中的甲酸比例为0.01％
‑
1％。
[0020]具体地，所述梯度洗脱的程序为：
[0021]流动相A+流动相B＝100％；0
‑
0.5min，流动相B体积百分比维持在0％
‑
40％；0.5
‑
2.5min，流动相B体积百分比由0％
‑
40％增至40％
‑
100％；2.50
‑
2.51min，流动相B体积百分比由40％
‑
100％递减至40％
‑
0％；2.51
‑
3.00min，流动相B保持体积百分比为0％
‑
40％。
[0022]具体地，步骤3)中，所述液相色谱质谱联用仪的质谱参数为：
[0023]离子源为电喷雾离子源；离子模式设置为正离子模式；监测模式为多反应监测；驻留时间为0.108s；锥孔电压为10～50V；毛细管电压为0.3～0.6V；脱溶剂气温度为450～650℃；脱溶剂气流速为1000L/Hr；锥孔气流速为150L/Hr；定量离子对为Ang I：433.1
±
0.5
→
647.5
±
0.5，Ang I
‑
IS：435.1
±
0.5
→
653.5
±
0.5。
[0024]具体地，步骤3)中，所述内标法包括以下步骤：
[0025]S1、配制一系列浓度梯度的血管紧张素I标准溶液以及血管紧张素I内标溶液；
[0026]S2、向所述血管紧张素I标准溶液中加入血管紧张素I内标溶液，再加入蛋白沉淀剂进行前处理；
[0027]S3、对血管紧张素I标准溶液进行液相色谱质谱检测，对血管紧张素I标准溶液中的血管紧张素I及其内标的峰面积进行采集并处理，将血管紧张素I对其内标物的峰面积的比值与血管紧张素I的浓度进行线性回归产生标准曲线和拟合方程；
[0028]S4、向样本中加入血管紧张素I内标溶液，再加入蛋白沉淀剂进行前处理；
[0029]S5、将样本上样至液相色谱质谱联用仪进行检测，对样本中的血管紧张素I及其内标的峰面积进行采集，将血管紧张素I与其内标物的峰面积的比值带入步骤S3中得到的标准曲线和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)配制缓冲体系，对样本进行孵育，所述缓冲体系中包含血管紧张素转化酶抑制剂；2)向孵育后的样本中加入内标液和蛋白沉淀剂，对样本进行前处理；3)取经过前处理后的上清液，采用液相色谱质谱联用仪进行检测，采用内标法，结合色谱系统和质谱系统，将进样样品中的物质分离并对血管紧张素I进行定量及定性检测；4)计算单位时间内单位体积的样本中的血管紧张素I的生成速率。2.根据权利要求1所述的人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，步骤1)中所述样本包括校正样本、质控样本和病人样本，所述孵育是指将孵化液和样本按照2:3的比例混合后，置于96孔板中进行孵化。3.根据权利要求2所述的人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，所述孵化为在37℃条件下水浴孵化1.5
‑
5小时。4.根据权利要求1所述的人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述内标液为血管紧张素I内标溶液，所述血管紧张素I内标溶液的浓度为10
‑
200ng/mL；所述蛋白沉淀剂包括有机溶剂、金属盐或强酸。5.根据权利要求4中所述的人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，所述蛋白沉淀剂为含有甲酸的乙腈或含有甲酸的甲醇，所述甲酸的含量为0.1％
‑
10％。6.根据权利要求1所述的人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述样本的体积为50
‑
500μL。7.根据权利要求1所述的人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述液相色谱质谱联用仪的色谱条件为：色谱柱为反相柱，进样体积为0.5
‑
50μL；柱温为25
‑
60℃；流速为0.3
‑
2mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；流动相A为甲酸水溶液，流动相B为含有甲酸的甲醇液或含有甲酸的乙腈液。8.根据权利要求7所述的人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，所述流动相A和流动相B中的甲酸比例为0.01％
‑
1％。9.根据权利要求7所述的人血浆肾素活性液相色谱质谱联用检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：流动相A+流动相B＝100％；0
‑
0.5min，流动相B体积百分比维持在0％
‑
40％；0.5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：方焯，刘釜均，耿志华，叶霄伟，顾祁昕，
申请(专利权)人：上海药明奥测医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：