一种基因突变位点的定位方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种基因突变位点的定位方法，包括以下步骤：将核酸片段N1

【技术实现步骤摘要】
一种基因突变位点的定位方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基因突变位点的定位方法。

技术介绍

[0002]基因突变是基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。基因突变是导致很多遗传性疾病的主要原因，随着基因测序技术的发展，使得测序得到特定的基因突变位点成为可能，准确预测这些基因突变位点与遗传疾病的关联无疑为遗传疾病的诊断提供了新思路，这就需要先对这些基因突变位点定位。
[0003]当样品中存在多个基因突变，需要定位其是否来源于同一条模板时：若多个基因突变在基因组上的位置相距几百bp，一代测序可以判断其是否来源于同一条模板；若多个基因突变在模板上的位置相距几千到几万bp，Pacbio三代测序可以判断其是否来源于同一条模板，但是Pacbio三代测序仪目前市场普及度远远不如二代测序仪，且其进行目标区域测序判断突变位置时，建库步骤复杂、成本高、起始模板投入量高；若多个基因突变在模板上的位置达到几十万bp时，还没有相对成熟且准确的方法判断其是否来源于同一条模板。基于此，提供一种基因突变位点的定位方法显得尤为重要。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种基因突变位点的定位方法，使来源于不同模板的扩增产物携带不同的特异性分子标签UMI，进行二代测序，通过判断不同的扩增产物携带的UMI标签的序列即可分辨各扩增产物是否扩增自同一模板，进而可对基因突变位点进行定位。
[0005]说明书中提到的核酸片段的反向均为5
’‑3’
。
[0006]根据本专利技术的一个方面，提出了一种基因突变位点的定位方法，包括以下步骤：
[0007]S1：提供第一油相和第一水相，所述第一水相为制备核酸片段N1
‑
N2
‑
UMI
‑
N3(5
’‑3’
)的反应体系，混合所述第一油相和所述第一水相形成第一微反应器，将所述核酸片段N1
‑
N2
‑
UMI
‑
N3配置于不同的所述第一微反应器中，使每个所述第一微反应器中配置的所述核酸片段上的UMI标签序列不同；其中所述UMI标签序列为包括8～12个碱基的随机序列，N1、N2和N3分别为包括13～20个碱基的固定序列；
[0008]S2：提供包含基因突变位点的样本，将所述样本中的每个模板和所述核酸片段N1
‑
N2
‑
UMI
‑
N3配置于不同的第二微反应器中；
[0009]S3：扩增所述模板得扩增产物，使位于一个所述第二微反应器中的所述扩增产物携带相同的所述UMI标签序列，比对所述UMI标签序列，若所述UMI标签序列相同，则所述扩增产物来源于同一个所述模板；若所述UMI标签序列不同，则所述扩增产物来源于不同的所述模板；进而判断所述基因突变位点在所述模板上的定位。
[0010]根据本专利技术的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
[0011]本专利技术将样本中的每条模板配置在不同的微反应器中，并在每个微反应器中配置
一种UMI标签序列，使每个微反应器中的扩增产物(即来源于同一模板)携带相同的UMI标签序列，各个微反应器之间的扩增产物(即来源于不同的模板)携带不同的UMI标签序列，根据UMI标签序列即可分辨基因突变位点来源于哪条模板，解决了测序过程中无法判断不同的突变位点是否来源于同一模板的问题。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸片段N1
‑
N2
‑
UMI
‑
N3是以核酸片段N2
‑
UMI
‑
N3为模板，载体
‑
N1
‑
N2为上游引物，核酸片段N3
’
为下游引物经乳液PCR获得的。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述载体被配置为磁珠。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸片段N3
’
为包括13～20个碱基的固定序列，所述核酸片段N3
’
与所述N3反向互补配对。
[0015]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述UMI标签序列被配置为包括8个碱基的随机序列。
[0016]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述N1为包括20个碱基的固定序列，序列信息如SEQ ID NO:1所示。
[0017]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述N2为包括13个碱基的固定序列，序列信息如SEQ ID NO:2所示。
[0018]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述N3为包括16个碱基的固定序列，序列信息如SEQ ID NO:3所示。
[0019]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述核酸片段N3
’
为包括16个碱基的固定序列，序列信息如SEQ ID NO:4所示。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸片段N1
‑
N2
‑
UMI
‑
N3被配置在所述载体上，所述载体连接与所述核酸片段的5
’
端相连。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述第一微反应器为油包水乳液颗粒，按所述第一油相和所述第一水相的体积比为(3～3.5)：1配制而成。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述第一油相按稳定剂1：稳定剂2：乳化剂＝75：4：(800～1000)的体积比配制而成；所述稳定剂1包括司盘80、吐温80、吐温60或吐温20中的至少一种；所述稳定剂2包括TritonX
‑
100或TritonX
‑
114中的至少一种；所述乳化剂包括三聚甘油单硬脂酸酯或甘油硬脂酸酯中的至少一种。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S2中所述的模板为所述样本中的各DNA模板，所述模板中含有所述基因突变位点。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S2中，将所述样本中的每个模板和所述核酸片段N1
‑
N2
‑
UMI
‑
N3配置于不同的第二微反应器中的方法为乳液PCR，包括制备所述第二微反应器和PCR扩增。
[0025]在本专利技术的一些实施方式中，制备所述第二微反应器的方法包括配制第二油相、第二水相，混合所述第二油相和所述第二水相；
[0026]配制所述第二油相的方法：按稳定剂1：稳定剂2：乳化剂＝75：4：(800～1000)的体积比配制而成；所述稳定剂1包括司盘80、吐温80、吐温60或吐温20中的至少一种；所述稳定剂2包括TritonX
‑
100或TritonX
‑
114中的至少一种；所述乳化剂包括三聚甘油单硬脂酸酯或甘油硬脂酸酯中的至少一种；
[0027]所述第二水相包括引物对、所述样本中的所述模板、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因突变位点的定位方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：提供第一油相和第一水相，所述第一水相为制备核酸片段N1
‑
N2
‑
UMI
‑
N3的反应体系，混合所述第一油相和所述第一水相形成第一微反应器，将所述核酸片段N1
‑
N2
‑
UMI
‑
N3配置于不同的所述第一微反应器中，使每个所述第一微反应器中配置的所述核酸片段上的UMI标签序列不同；其中所述UMI标签序列为包括8～12个碱基的随机序列，N1、N2和N3分别为包括13～20个碱基的固定序列；S2：提供包含基因突变位点的样本，将所述样本中的每个模板和所述核酸片段N1
‑
N2
‑
UMI
‑
N3配置于不同的第二微反应器中；S3：扩增所述模板得扩增产物，使位于一个所述第二微反应器中的所述扩增产物携带相同的所述UMI标签序列，比对所述UMI标签序列，若所述UMI标签序列相同，则所述扩增产物来源于同一个所述模板；若所述UMI标签序列不同，则所述扩增产物来源于不同的所述模板；进而判断所述基因突变位点在所述模板上的定位。2.根据权利要求1所述的定位方法，其特征在于，所述核酸片段N1
‑
N2
‑
UMI
‑
N3是以核酸片段N2
‑
UMI
‑
N3为模板，载体
‑
N1
‑
N2为上游引物，核酸片段N3
’
为下游引物经乳液PCR获得的；所述载体被配置为磁珠。3.根据权利要求2所述的定位方法，其特征在于，所述核酸片段N3
’
为包括13～20个碱基的固定序列，所述核酸片段N3
’
与所述N3反向互补配对。4.根据权利要求2所述的定位方法，其特征在于，所述核酸片段N1
‑
N2
‑
UMI
‑
N3被配置在所述载体上，所述载体与所述核酸片段的5
’
相连。5.根据权利要求1所述的定位方法，其特征在于，所述第一微反应器为油包水乳液颗粒，按所述第一油相和所述第一水相的体积比为(3～3.5)：1配制而成；所述第一油相按稳定剂1：稳定剂2：乳化剂＝75：4：(800～1000)的体积比配制而成；所述稳定剂1包括司盘80、吐温80、吐温60或吐温20中的至少一种；所述稳定剂2包括TritonX
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：程云阳，巴颖，操利超，张核子，卢晓萍，
申请(专利权)人：深圳市核子基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：