一种检测病毒及其突变体的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种无标记和等温检测病毒及其突变体的试剂盒，其特征在于，包括如下部分：(1)含切割识别序列的预引物；(2)从5

【技术实现步骤摘要】
一种检测病毒及其突变体的试剂盒和方法


[0001]本专利技术属于病毒检测领域。具体涉及一种检测病毒及其突变体的试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]全球流行病学数据表明，随着新型冠状病毒肺炎(COVID
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19)的病原体新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)的传播，毒株的变异也随之产生，并导致更高的传播率和更强的免疫逃逸反应。例如新冠病毒刺突蛋白(S蛋白)中的错义突变(N501Y)能使SARS
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CoV
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2病毒的传播速度增加70％。突变毒株的出现给新型冠状病毒的检测提出了新的要求。快速开发高效，准确的突变检测方法，势必成为应对病毒突变，有效控制传播的关键。然而，现有的新型冠状病毒检测方法，包括核酸分子识别和血清免疫检测都无法准确检出突变。因此，亟需构建快速、低成本和高通量变异新冠病毒检测和筛查试剂盒。
[0003]CRISPR
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Cas(聚簇的规则间隔的短回文重复序列)是一类特殊的核酸蛋白复合体，一般具有RNA降解酶(RNase)或DNA降解酶(DNase)的活性，使得 CRISPR/Cas系统成为下一代诊断平台的完美候选物。其中，CRISPR/Cas13a 是唯一以RNA为靶点的CRISPR效应体，具有超强的信号放大能力。 CRISPR
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Cas13a系统由一个Cas13a蛋白和一个crRNA组成。靶RNA被crRNA 特异性识别并激活Cas13a的RNA酶活性，对所处环境中的其它RNA分子进行非特异性的切割，被称作“旁切割”(collateral cleavage)。CRISPR
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Cas13a系统在SARS
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CoV
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2病毒诊断中具有广阔的应用前景。取消昂贵的探针(如淬灭剂和荧光基团修饰的RNA探针)和昂贵的仪器(如热循环仪)，预计将促进其在资源有限地区的SARS
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CoV
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2病毒常规检测中的使用。
[0004]目前，利用CRISPR/Cas系统进行病毒检测的试剂、方法的报道较少，进一步开发高效、准确的基于CRISPR/Cas系统的病毒检测试剂，丰富病毒核酸检测和筛查的手段，仍具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的问题是：提供一种无标记和等温检测新冠病毒和/或其突变体的试剂盒。
[0006]本专利技术提供了一种病毒和/或其突变体的试剂盒，包括如下部分：
[0007](1)预引物；
[0008](2)转录模板；
[0009](3)靶向病毒和/或其突变体的crRNA或其DNA模板；
[0010](4)Cas13蛋白；
[0011](5)体外转录试剂；
[0012](6)病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增用引物；
[0013](7)去磷酸化试剂；
[0014]所述预引物、转录模板的序列满足如下条件：
[0015]所述转录模板序列为一段DNA，由从5
’
端至3
’
端依次连接的适配体互补序列、T7启动子互补序列、间隔序列和引物前锚序列构成；
[0016]所述预引物序列由从5
’
端至3
’
端依次连接的成熟引物序列、切割识别序列和末端序列构成；
[0017]所述成熟引物序列为至少有15个碱基的DNA序列，且与所述引物前锚序列反向互补；
[0018]所述切割识别序列为UU与AU或AA与UA；所述间隔序列的最后一位碱基与切割识别序列的第一位碱基互补，间隔序列的倒数第二位碱基与切割识别序列的第二位碱基不互补；
[0019]所述末端序列为随机DNA碱基序列，且不与转录模板序列互补；
[0020]所述crRNA为一段RNA，序列包括2部分：1)向导序列：负责与病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增产物进行互补配对，形成双链；2)锚定序列：位于向导序列的5
’
端，依赖其二级结构，可结合Cas13蛋白；
[0021]所述Cas13蛋白为Lwacas13a或Lbucas13a；
[0022]所述ssRNA体外扩增用引物分为正向引物和反向引物，正向引物的5
’
端添加有T7启动子序列。
[0023]进一步地，上述crRNA与Cas 13a结合后形成Cas 13a
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crRNA复合物， Cas 13a
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crRNA复合物中，crRNA的向导序列与病毒和/或其突变体的ssRNA 体外扩增产物形成双链，构成Cas13a
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crRNA/ssRNA复合物的情况下激活 Cas13蛋白的反式酶切活性；
[0024]所述预引物经Cas13a
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crRNA/ssRNA复合物在切割识别序列处切割后，经去磷酸化试剂去磷酸化从而释放出成熟引物，成熟引物与转录模板的引物前锚序列杂交，形成转录扩增起始复合物；
[0025]所述转录扩增起始复合物经体外转录试剂生成发光RNA适配体。
[0026]进一步地，上述切割识别序列为UU，Cas13蛋白为Lwacas13a。
[0027]更进一步地，上述体外转录试剂包括T7 RNA聚合酶；所述去磷酸化试剂包括T4多聚核苷酸激酶。
[0028]更进一步地，上述试剂盒还包括无外切酶活性的Klenow片段。
[0029]更进一步地，上述病毒为新冠病毒；所述病毒的突变体是新冠病毒S基因发生N501Y突变形成的突变体。
[0030]更进一步地，上述试剂盒中，
[0031]所述预引物序列如SEQ ID NO.1所示；
[0032]所述转录模板序列如SEQ ID NO.2所示；
[0033]所述靶向病毒的crRNA的序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示；
[0034]所述病毒的ssRNA体外扩增用引物序列的正向引物序列如SEQ ID NO.5 所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示，或，正向引物序列如SEQ ID NO.7 所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；
[0035]所述靶向病毒突变体的crRNA的序列如SEQ ID NO.9所示；
[0036]所述病毒突变体的体外扩增用引物的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。
[0037]进一步地，上述生成的发光RNA适配体可以特异性结合核酸染料，并使染料荧光增强。
[0038]更进一步地，上述RNA适配体为下列适配体中的至少一种：Broccoli、 Spinach、Spinach2；
[0039]所述核酸染料为如下核酸染料中的至少一种： 3,5
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difluoro
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hydroxybenzylid本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种病毒和/或其突变体的试剂盒，其特征在于，包括如下部分：(1)预引物；(2)转录模板；(3)靶向病毒和/或其突变体的crRNA或其DNA模板；(4)Cas13蛋白；(5)体外转录试剂；(6)病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增用引物；(7)去磷酸化试剂；所述预引物、转录模板的序列满足如下条件：所述转录模板序列为一段DNA，由从5
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端至3
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端依次连接的适配体互补序列、T7启动子互补序列、间隔序列和引物前锚序列构成；所述预引物序列由从5
’
端至3
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端依次连接的成熟引物序列、切割识别序列和末端序列构成；所述成熟引物序列为至少有15个碱基的DNA序列，且与所述引物前锚序列反向互补；所述切割识别序列为UU与AU或AA与UA；所述间隔序列的最后一位碱基与切割识别序列的第一位碱基互补，间隔序列的倒数第二位碱基与切割识别序列的第二位碱基不互补；所述末端序列为随机DNA碱基序列，且不与转录模板序列互补；所述crRNA为一段RNA，序列包括2部分：1)向导序列：负责与病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增产物进行互补配对，形成双链；2)锚定序列：位于向导序列的5
’
端，依赖其二级结构，可结合Cas13蛋白；所述Cas13蛋白为Lwacas13a或Lbucas13a；所述ssRNA体外扩增用引物分为正向引物和反向引物，正向引物的5
’
端添加有T7启动子序列。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA与Cas 13a结合后形成Cas 13a
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crRNA复合物，Cas 13a
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crRNA复合物中，crRNA的向导序列与病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增产物形成双链，构成Cas13a
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crRNA/ssRNA复合物的情况下激活Cas13蛋白的反式酶切活性；所述预引物经Cas13a
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crRNA/ssRNA复合物在切割识别序列处切割后，经去磷酸化试剂去磷酸化从而释放出成熟引物，成熟引物与转录模板的引物前锚序列杂交，形成转录扩增起始复合物；所述转录扩增起始复合物经体外转录试剂生成发光RNA适配体。3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述切割识别序列为UU，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李为民，薛婷，刘彤，王誉熹，邓锐杰，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：