STAT2基因缺失细胞株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物学及遗传学技术领域，公开了一株STAT2基因缺失细胞株及其制备方法和应用。本发明专利技术选用HEK293细胞建立稳定细胞株，其具有产毒量高、无致瘤性的优点，而且节约了病毒生产、制备的时间，提高病毒回收效率，降低了生产成本。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术对细胞的STAT2基因进行特异性靶向敲除获得STAT2基因缺失的细胞株，方法简单，可复制性强，敲除效率极高，在优选的实施方案中，通过利用含有报告载体的基因敲除系统，能够快速直观的筛选目标细胞。标细胞。标细胞。

【技术实现步骤摘要】
STAT2基因缺失细胞株及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学及遗传学
，具体涉及一株STAT2基因缺失细胞株及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]CRISPR
‑
Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。本专利技术的原理和最核心的关键技术是一个Cas9核酸酶利用向导RNA(gRNA)就可以完成识别和切割靶双链DNA。该技术由于突变效率高、成本低廉、适用范围广等许多优点，是最具有临床与应用前景的基因治疗技术之一。
[0003]病毒包装是利用脂质体等转染试剂将包含病毒复制所需要基因的质粒共转染到宿主细胞，利用宿主细胞提供能量和原料场所，生产出具有感染能力病毒的过程，常用于稳定细胞系的构建、基因治疗和细胞治疗等领域。目前用于病毒包装的常用细胞株为293T细胞。该细胞具有转染效率好、病毒产量高等特点。然而，该细胞存在SV40 largeT抗原，存在一定致瘤风险，因此，在采用293T细胞作为病毒包装所用的宿主细胞时，需要后续纯化步骤去除SV40 largeT抗原，同时也要在质量控制环节对该蛋白进行检测，从而增加了处理流程，提高了病毒包装成本。
[0004]HEK293细胞又叫人胚胎肾细胞293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有转染效率高，易于培养等特点，极少表达细胞外配体所需的内生受体，是一个非常适合表达研究外源基因的细胞株。
[0005]目前，尚没有研究公开STAT2基因缺失的细胞株，也没有公开任何STAT2基因缺失的细胞株的产毒效率。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的产毒效率低、包装病毒效率低、宿主细胞存在致瘤风险等需要解决的问题，提供STAT2基因缺失细胞株、构建方法、应用及包装病毒的方法，该细胞株为STAT2基因缺失的细胞株，用在包装病毒中时，能够稳定高效地包装病毒，病毒滴度高。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术一方面提供一株细胞株，所述细胞株为STAT2基因缺失细胞株。
[0008]本专利技术第二方面提供一种构建STAT2基因缺失细胞株的方法，该方法包括：
[0009](1)使用STAT2基因敲除用的载体系统转染目标细胞，得到转染后的目标细胞；
[0010](2)将所述转染后的目标细胞进行单克隆筛选得到单克隆，进行将所述单克隆进行PCR鉴定，得到阳性克隆；
[0011](3)将所述阳性克隆进行扩大培养，得到STAT2基因缺失细胞株；
[0012]其中，所述载体系统包括表达载体，所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1和sgRNA2。
[0013]本专利技术第三方面提供如前所述的方法制备的细胞株。
[0014]本专利技术第四方面提供如前所述的细胞株在包装病毒或扩繁病毒中的应用。
[0015]本专利技术第五方面提供一种包装病毒的方法，该方法包括将病毒包装至如前所述的细胞株中。
[0016]本专利技术第六方面提供敲除STAT2基因的方法或试剂在提高细胞产毒量中的应用。
[0017]通过上述技术方案，本专利技术首次利用CRISPR/Cas9技术构建STAT2基因缺失的HEK293细胞株，能包装或扩繁多种病毒，如慢病毒、腺病毒等，因此可作为包装(扩繁)病毒的理想型细胞株。具体地，本专利技术获得的有益技术效果是：
[0018](1)本专利技术的STAT2基因缺失的细胞株，能够高效包装慢病毒，高效扩繁腺病毒。
[0019](2)本专利技术选用HEK293细胞建立稳定细胞株，该细胞本身要比常用的293T细胞产毒量高，而且该细胞不含SV40 largeT抗原，解决了致瘤性的问题。而且，由于该细胞株不含有致瘤性的基因，从而能够减少下游纯化和质量控制检测的步骤，节约病毒生产、制备的时间，提高病毒回收效率，降低生产成本。
[0020](3)本专利技术获得的稳定细胞株质粒转染效率高，出毒滴度高，可大大降低生产成本；
[0021](4)在优选的实施方式中，本专利技术利用CRISPR/Cas9技术对细胞的STAT2基因进行特异性靶向敲除获得STAT2基因缺失的细胞株，方法简单，可复制性强，敲除效率极高；本专利技术针对STAT2基因设计、使用两个sgRNA，可实现对STAT2基因的大片段删除；本专利技术的基因敲除系统含有报告载体，只有当Cas9、sgRNA1、sgRNA2均能够发生作用时(即能够成功敲除STAT2基因片段时)，细胞才能够表达荧光，因此通过观察细胞GFP荧光，可快速直观的判断是否敲除成功，极大的提高了筛选效率。
附图说明
[0022]图1为实施例1步骤(1)中设计的STAT2基因引物的PCR鉴定电泳图。M:2000 DNA marker，1：STAT2基因片段，2：阴性对照；
[0023]图2为实施例1步骤(2)(c)中构建的sgRNA1表达载体和sgRNA2表达载体的电泳图。M:15000DNA marker，1：sgRNA1表达载体，2：sgRNA2表达载体；
[0024]图3为实施例1步骤(3)中骨架载体pIRES
‑
EGFP(Clontech公司)(T1)的PCR电泳图。M:15000DNA marker，1：骨架载体pIRES
‑
EGFP的PCR产物，2：以无菌水为模板的PCR阴性对照；
[0025]图4为实施例1步骤(3)中T2的PCR电泳图。M:2000DNA marker，1：以无菌水为模板的PCR阴性对照，2：T2的PCR产物
[0026]图5为实施例1中CMV
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sgRNA1靶序列
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PolyA
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sgRNA2靶序列
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IRES
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GFP报告载体图谱；
[0027]图6为实施例1步骤(5)中HEK293分选单克隆的PCR鉴定电泳图。M:DNA marker，WT：空白组细胞提取基因组PCR产物，1
‑
9：9个克隆提取基因组的PCR产物；
[0028]图7为实施例1步骤(5)中HEK293分选单克隆的PCR产物测序结果进行序列比对分
析图。
[0029]图8为实施例2步骤(1)慢病毒包装所使用的市售慢病毒包装质粒图谱。A:PLVX
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mCherry
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C1；B:PLP1；C：PLP2；D:PLP
‑
VSVGC；
[0030]图9为实施例2步骤(1)慢病毒包装质粒转染三种不同细胞系的转染效果图。A：实验组1的Mcherry荧光，B：实验组1的明场，C：实验组2的Mcherry荧光D：实验组2的明场，E：实验组3的Mcherry荧光，F：实验组3的明场；
[0031]图10为实施例2步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株细胞株，其特征在于，所述细胞株为STAT2基因缺失细胞株。2.根据权利要求1所述的细胞株，其中，该细胞株为STAT2基因缺失的HEK293细胞株。3.一种构建STAT2基因缺失细胞株的方法，其特征在于，该方法包括：(1)使用STAT2基因敲除用的载体系统转染目标细胞，得到转染后的目标细胞；(2)将所述转染后的目标细胞进行单克隆筛选得到单克隆，将所述单克隆进行PCR鉴定，得到阳性克隆；(3)将所述阳性克隆进行扩大培养，得到STAT2基因缺失细胞株；其中，所述载体系统包括表达载体，所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1和sgRNA2。4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(3)中，所述单克隆筛选为有限稀释法和/或流式细胞仪分选技术；和/或，所述目标细胞为HEK293细胞。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述载体系统还包括报告载体，步骤(2)所述单克隆筛选为阳性单克隆筛选；所述报告载体含有启动子、荧光蛋白表达元件与位于启动子和荧光蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：许傲天，白晓，张起起，
申请(专利权)人：北京镁伽科技有限公司，
类型：发明
国别省市：