表达靶向PD-1/PD-L1的效应RNA分子的多能干细胞及其衍生物制造技术

本发明专利技术公开了一种表达靶向PD

【技术实现步骤摘要】
表达靶向PD-1/PD-L1的效应RNA分子的多能干细胞及其衍生物


[0001]本专利技术属于基因工程
具体涉及一种表达靶向PD-1/PD-L1的效应RNA分子的多能干细胞及其衍生物，以及相关的应用。

技术介绍

[0002]PD-1是程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员。PD-1属I型跨膜蛋白，由胞外段、跨膜锚定区以及胞内信号转导区三部分构成，主要诱导表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞表面。PD-1的配体是B7-H1(PD-L1)和B7-DC(PD-L2)，二者结合后抑制T细胞增殖活化，对T细胞应答起负调节作用，属于抑制性受体。肿瘤细胞表面常表达PD-L1，与T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞增殖活化，实现免疫逃逸。目前市场上已经有PD-1和PD-1抗体，阻断肿瘤细胞对T细胞的抑制作用。在人体内除了存在跨膜结合蛋白PD-1，也存在可溶性PD-1(sPD-1)，sPD-1保留了模型分子的胞外Ig V-Ig C样结构域，能够结合于配体PD-L1和PD-L2。最初有关sPD-1的研究多与自身免疫疾病相关，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重度肌无力等自身免疫疾病均被证明与sPD-1有关，sPD-1也被认为是在自身免疫疾病中，由免疫细胞在促炎症刺激因子的作用下产生。同样，sPD-1具有与PD-L1结合的能力，起到促进T细胞活性的功能。PD-1，PD-L1已成为治疗肿瘤的新靶点，目前国外已上市的抗PD-1抗体药物有百时美施宝贵的Nivolumab、默沙东的Keytruda等。但是这类抗体药物的作用时间短，需要长期进行注射，对于病人来说需要花费高昂的费用。因此，研发一种可以在人体内源源不断地表达PD-1/PD-L1阻断物的多能干细胞或其衍生物，对于癌症治疗来说具有极为重要的意义。
[0003]外泌体是指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。目前已经尝试用外泌体携带siRNA、化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。
[0004]另一方面，在细胞治疗领域，同种异体的免疫兼容问题依然是一大难题。近年已有许多报道通过敲除B2M、CIITA等基因，实现HLA-I和HLA-II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型PSCs，为更广泛的通用型PSCs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达CTLA4-Ig、PD-L1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除B2M、CIITA的同时，敲入CD47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸NK等细胞的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。
DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；
[0023](4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。
[0024]作为优选的：
[0025]所述靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.34～SEQ ID NO.121中的至少一种；
[0026]所述靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.33中的至少一种。
[0027]作为优选的：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子，其中：shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因包括Dhrosha、Ago1、Ago2、Dicer1、Exportin-5、TRBP(TARBP2)、PACT(PRKRA)、DGCR8中的至少一种；所述抗干扰素效应分子为靶向PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7中的至少一种的shRNA和/或shRNA-miR。
[0028]作为优选的：所述靶向PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.122～SEQ ID NO.181中的至少一条。
[0029]作为优选的：所述靶向PD-1、PD-L1、主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA或shRNA-miR的表达框架如下：
[0030](1)shRNA表达框架：由5
’
到3
’
依次包括shRNA靶序列、茎环序列、shRNA靶序列的反向互补序列、Poly T；两个反向互补靶序列由中间一茎环序列分隔组成发夹结构，最后连上Poly T作为RNA聚合酶III的转录终止子。
[0031]作为优选的，所述shRNA表达框架中的环序列长度为3～9个碱基；所述poly T长度为5～6个碱基。
[0032](2)shRNA-miR表达框架：使用权利要求7或9所述shRNA-miR靶序列替换microRNA-30或者microRNA-155中的靶序列得到。
[0033]上述表达框架可根据需要在5
’
端加上组成型启动子或诱导型启动子，例如U6启动子、H1启动子，以及配套的启动子调控元件。
[0034]作为本专利技术的另一个优选技术方案：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基因表达系统，用于调控免疫兼容分子和/或shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子的表达，从而得到一种免疫兼容可逆的表达PD-1和/或PD-L1阻断物的多能干细胞或其衍生物。
[0035]作为优选的：所述诱导型基因表达系统包括Tet-Off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。
[0036]作为优选的，所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入外泌体加工合成基因，所述外泌体加工合成基因包括STEAP3、Syndevan-4、L-天冬氨酸氧化酶片段、CD63-L7Ae和Cx43 S368A中的至少一种。
[0037]在干细胞或其衍生物的基因组中导入外泌体加工合成基因可以提高外泌体的分泌效率，及其对shRNA、shmiRNA和加工成熟的siRNA的包裹效率。
[0038]作为优选的：以上所述PD-1和/或PD-L1阻断物的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有PD-1和/或PD-L1阻断物的表达序列；所述PD-1阻断物为靶向PD-1的shRNA和/或shRNA-miR中的至少一种；所述PD-L1阻断物为靶向PD-L1的shRNA和/或shRNA-miR中的至少一种。2.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：(1)靶向PD-1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示；(2)靶向PD-L1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20所示。3.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物基因组的B2M基因和/或CIITA基因被敲除。4.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入至少一种免疫兼容分子的表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。5.根据权利要求4所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述与免疫应答相关的基因包括：(1)主要组织相容性复合体基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种。6.根据权利要求4所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述所述免疫兼容分子包括以下的至少一种：(1)免疫耐受相关基因，包括CD47和HLA-G中的至少一种；(2)HLA-C类分子，包括人群中比例合计超过90％的HLA-C复等位基因，或者超过90％的HLA-C复等位基因与B2M构成的融合蛋白基因；(3)靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；(4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。7.根据权利要求6所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.34～SEQ ID NO.121中的至少一种；所述靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.33中的至少一种。8.根据权利要求1-7任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子，其中：shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因包括Dhrosha、Ago1、Ago2、Dicer1、Exportin-5、TRBP(TARBP2)、PACT(PRKRA)、DGCR8中的至少一种；所述抗干扰素效应分子为靶向PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7中的至少一种的shRNA和/或shRNA-miR。9.根据权利要求8所述的多能干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淋立，陈月花，杨建国，莫健，
申请(专利权)人：王淋立，
类型：发明
国别省市：