表达靶向CTLA-4的shRNA/shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物制造技术

本发明专利技术公开了一种表达含有CTLA

【技术实现步骤摘要】
表达靶向CTLA-4的shRNA/shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种表达靶向CTLA-4的shRNA/shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物。

技术介绍

[0002]细胞毒T淋巴细胞相关抗原(4cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)又名CD152，是由CTLA-4基因编码的一种跨膜蛋白质，表达于活化的T细胞，与T细胞表面的协同刺激分子受体(CD28)具有高度的同源性，共同享有B7分子配体(B7-1/CD80，B7-2/CD86)，而CTLA-4与B7分子结合后能负下调T细胞的反应活性，参与免疫反应的负向调节，因此是一种免疫共抑制分子。其机制，一是与CD28竞争性的结合B7或者招募磷酸酶到CTLA-4的胞内结构域部分从而降解T细胞受体(TCR)和CD28的信号，二是降低CD80/CD86在APC的表达水平或者通过转胞吞作用将它们从APC上移除，这样就减少了CD28参与激活T细胞。此外，CTLA-4还会介导树突细胞结合CD80/CD86并诱导色氨酸降解酶IDO的表达，从而导致TCR的抑制。伴随外源性抗原或肿瘤特异性靶抗原的刺激，T细胞被激活，CTLA-4表达水平上升抑制T细胞的免疫反应。因此阻断CTLA-4的免疫效应可刺激T细胞增殖，从而诱导或增强抗肿瘤免疫反应。基因重组的CTLA-4Ig可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用极低，是目前被认为较有希望的新的免疫抑制药物。
[0003]外泌体是指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。目前已经尝试用外泌体携带siRNA、化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。
[0004]此外，在细胞治疗领域，同种异体的免疫兼容问题依然是一大难题。近年已有许多报道通过敲除B2M、CIITA等基因，实现HLA-I和HLA-II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型PSCs，为更广泛的通用型PSCs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达CTLA4-Ig、PD-L1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除B2M、CIITA的同时，敲入CD47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸NK等细胞的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的在于提供一种多能干细胞或其衍生物，其能表达靶向CTLA-4的shRNA和/或shRNA-miR。
[0006]本专利技术的第二个目的在于提供一种免疫兼容的多能干细胞或其衍生物，其能表达靶向CTLA-4的shRNA和/或shRNA-miR。该干细胞或衍生物具有同种异体免疫兼容的能力，免疫兼容的方案包括：将多能干细胞或其衍生物基因组中的B2M和/或CIITA基因敲除；或者在多能干细胞或其衍生物的基因组敲入免疫兼容分子的表达序列。
[0007]本专利技术的第三个目的在于提供一种免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物，其能表达靶向CTLA-4的shRNA和/或shRNA-miR。
[0008]本专利技术所采取的技术方案是：
[0009]一种多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有CTLA-4阻遏分子的表达序列，所述CTLA-4阻遏分子为靶向CTLA-4的shRNA和/或shRNA-miR中的至少一种。
[0010]本专利技术研究发现，在多能干细胞或其衍生物中导入靶向CTLA-4的shRNA/shRNA-miR表达序列后，多能干细胞或其衍生物中分泌的外泌体中包含高丰度的靶向CTLA-4的shRNA/shmiRNA以及加工成熟的siRNA，外泌体携带这些效应RNA分子与靶细胞结合，然后将其释放，从而阻断CTLA-4通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，其能够有效清除肿瘤细胞。
[0011]作为优选的：所述靶向CTLA-4的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示。
[0012]作为本专利技术的另一个优选方案：所述多能干细胞或其衍生物基因组的B2M基因和/或CIITA基因被敲除。
[0013]作为本专利技术的另一个优选方案：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入至少一种免疫兼容分子的表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。
[0014]作为优选的：所述与免疫应答相关的基因包括：
[0015](1)主要组织相容性复合体基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；
[0016](2)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种。
[0017]作为优选的：所述所述免疫兼容分子包括以下的至少一种：
[0018](1)免疫耐受相关基因，包括CD47和HLA-G中的至少一种；
[0019](2)HLA-C类分子，包括人群中比例合计超过90％的HLA-C复等位基因，或者超过90％的HLA-C复等位基因与B2M构成的融合蛋白基因；
[0020](3)靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；
[0021](4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。
[0022]作为优选的：
[0023]所述靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.111中的至少一种；
[0024]所述靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
4、主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA或shRNA-miR的表达框架如下：(1)shRNA表达框架：由5
’
到3
’
依次包括shRNA靶序列、茎环序列、shRNA靶序列的反向互补序列、Poly T，所述shRNA靶序列如权利要求2、7或9所述；(2)shRNA-miR表达框架：使用权利要求2、7或9所述的shRNA-miR靶序列替换microRNA-30或者microRNA-155中的靶序列得到。11.根据权利要求10所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述茎环序列长度为3～9个碱基；所述poly T长度为5～6个碱基。12.根据权利要求4或8所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基因表达系统，用于调控免疫兼容分子和/或shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子的表达。13.根据权要求12所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述诱导型基因表达系统包括Tet-Off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。14.根据权利要求1-13任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入外泌体加工合成基因，所述外泌体加工合成基因包括STEAP3、Syndevan-4、L-天冬氨酸氧化酶片段、CD63-L7Ae和Cx43 S368A中的至少一种。15.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淋立，陈月花，杨建国，莫健，
申请(专利权)人：王淋立，
类型：发明
国别省市：