本发明专利技术涉及用于定性检测可可粉中可可源性成分的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用针对可可粉中可可成分的特异性寡核苷酸引物和荧光标记探针。本发明专利技术还涉及针对可可粉中可可成分的特异性寡核苷酸引物和荧光探针在定性检测可可源性成分中的应用。使用本发明专利技术的实时荧光PCR检测方法，能够准确灵敏地测定可可粉中可可源性成分。可可粉中可可源性成分。
【技术实现步骤摘要】
DNA序列在不同物种中具有差异性的特点而设计的。所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为Cocoa-F：TGGACATGCACTGATGAGAGA(SEQ ID No.1)，所述下游引物为Cocoa-R：GCTTTCAGTCCTTTGCTT(SEQ ID No.2)；所述探针为Cocoa-P：GAGAGGGTGGGAACCTTAGC(SEQ ID No.3)，在探针的3
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端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5
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端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方案中，本专利技术提供的可可特异性检测组合物，所述组合物包含特异性寡核苷酸引物对和探针。在一个优选的实施方案中，本专利技术提供了用于实时荧光PCR方法定性检测可可源性成分的组合物，所述组合物包含可可特异性寡核苷酸引物对和探针，其中所述可可特异性引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3
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端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5
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端连接有一个荧光报告基团FAM。
[0011]根据本专利技术的另一个实施方案，本专利技术提供可可源性成分的实时荧光PCR定性检测方法，所述方法包括使用针对可可源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针，所述引物对和探针是根据microsatellite DNA序列在不同物种中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，本专利技术的可可源性成分的实时荧光PCR定性检测方法中，所使用的可可特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3
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端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5
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端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方案中，所述的PCR扩增条件为95℃，10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。
[0012]根据本专利技术的再一个实施方案，本专利技术提供用于实时荧光PCR方法检测可可源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测食品中可可源性成分中的应用。在一个优选的实施方案中，本专利技术提供可可粉中可可源性成分的特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和特异性探针SEQ ID No.3，在可可microsatellite DNA探针的3
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端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5
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端连接有一个荧光报告基团FAM。
[0013]本专利技术以可可DNA为检测基础，根据microsatellite DNA序列在不同物种中具有差异性的特点，比对分析了可可microsatellite DNA序列。根据这些序列设计引物，利用实时荧光PCR法定性检测样品中的可可源性成分。
[0014]实时荧光定量PCR即在常规PCR方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染料，随着PCR产物的积累，探针或染料发出的荧光信号增强，而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每产生一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此可以实时监控整个PCR反应过程，并最终检测出待测样品的初始拷贝数，从而可检测待测可可粉中所含可可源性成分。
[0015]本专利技术的实时荧光PCR检测方法采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。本专利技术的方法巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。使用本专利技术的PCR检测方法，可用于定性检测，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上可可粉中可可源性成分的检测等。
附图说明
[0016]图1显示的是实时荧光PCR特异性检测可可成分的结果，其中使用特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2及SEQ ID No.3检测，其中基线上方为可可样品的扩增曲线，基线下方为马铃薯、玉米、大米、小米、绿豆、荞麦、黄豆、榛果、芝麻、核桃等11种植物样品及空白对照(无菌水)。
[0017]图2是对实时荧光PCR特异性检测可可成分的灵敏度进行评价，将可可DNA溶液10倍梯度稀释，依次为50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL以及空白对照(无菌水)。
[0018]图3是利用本专利技术建立的实时荧光PCR方法对市售可可粉样品进行检测的结果。基线以上为阳性对照(可可DNA)、市售可可粉3份(1#、2#、3#)以及空白对照(无菌水)。
具体实施方式
[0019]通过实施例的方式对本专利技术作进一步的说明，但是本专利技术并不仅仅局限于以下实施例。
[0020]实施例1
[0021]本实施例为通过如下试验对可可的引物对和探针进行特异性和灵敏度评价。
[0022]通过检测microsatellite DNA序列，可以确定可可引物探针组合的特异性和检测灵敏度。反应体系为：Fast Start Universal PCR Master Mix 12.5μL；探针(10μM)0.5μL；上、下游引物(10μM)各0.5μL；模板DNA 5μL；加无菌水至总体积为25μL。反应程序为95℃10min；95℃15s；60℃1min，40个循环。
[0023]所使用的检测可可的引物及探针序列为：
[0024]引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，探针序列为SEQ ID No.3，3
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端连接有一个荧光报告基团FAM。
[0025]所使用的检测主要仪器：
[0026]微量移液器(10μL、100μL、1000μL)、荧光定量PCR仪、高速台式离心机等。
[0027]检测主要试剂：
[0028]氯仿、异丙醇、CTAB裂解液(20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris、0.02mol/L Na
2-EDTA)、CTAB沉淀液(5g/L CTAB，0.04mol/L NaCl)、1.2mol/L NaCl、Fast Start Universal Probe Master Mix(Rox)；引物及探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0029]检测主要步骤：
[0030]1 DNA提取
[0031]检测样本：(1)可可、马铃薯、玉米、大米、小米、绿豆、荞麦、黄豆、榛果、芝麻、核桃等12种样品用于特异性分析；(2)将提取的可可DNA溶液用无菌水分别稀释为50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL的浓度，用于分析引物探针组合的检本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于实时荧光PCR方法检测可可源性成分的特异性寡核苷酸引物对和荧光标记探针组合物，其中所述引物对为Cocoa-F：TGGACATGCACTGATGAGAGA，所述下游引物为Cocoa-R：GCTTTCAGTCCTTTGCTT；所述探针为Cocoa-P：GAGAGGGTGGGAACCTTAGC。2.根据权利要求1所述的组合物...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩建勋，宋敬宁，侯卫静，
申请(专利权)人：谱尼测试集团上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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