一种血液中转甲状腺素蛋白(TTR)四聚体浓度测定的预处理方法和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种血液中转甲状腺素蛋白(TTR)四聚体浓度测定的预处理和检测方法，包括如下步骤：血液过膜后加入小分子荧光探针，进行孵育，使小分子荧光探针与TTR特异性结合而产生荧光；孵育后的样本加入稀释剂进行稀释、离心、取上清液后，采用高效液相色谱进行分离，利用荧光检测器进行定量分析。本发明专利技术操作简便，可实现血液中TTR四聚体浓度的定量测定，并通过TTR总浓度减去TTR四聚体浓度得出TTR错误折叠浓度，还可通过保留时间定性鉴别TTR四聚体为野生型或变异型，具有良好的选择性，精密度和准确度。密度和准确度。密度和准确度。

【技术实现步骤摘要】
一种血液中转甲状腺素蛋白(TTR)四聚体浓度测定的预处理方法和检测方法


[0001]本专利技术属于分析检测
，具体地说涉及一种用于检测血液类样本中转甲状腺素蛋白(TTR)四聚体浓度测定的预处理方法和检测方法。

技术介绍

[0002]前白蛋白，也称转甲状腺素蛋白(Transthyretin，简称TTR)，是由127个氨基酸组成，分子量为55KDa的四聚体蛋白。它主要由肝脏和大脑的脉络丛产生，也有少量由视网膜上皮细胞合成，然后分泌到血液和脑脊液中，具有转运甲状腺激素、结合RBP蛋白等功能。
[0003]通常，TTR由四个相同的单体组成，在ATTR淀粉样变性(ATTRAmyloidosis)中，四聚体蛋白的稳定性下降，蛋白质分解成二聚体和单体，呈现出部分展开的构象，并自组装成有毒的非原纤维聚集体，后来变成淀粉样蛋白原纤维。这些淀粉样化蛋白沉积在周边神经系统和心肌等组织，进而引发淀粉样多发性神经病(ATTR
‑
PN)和淀粉样变心肌病(ATTR
‑
CM)。
[0004]ATTR淀粉样变性分为两种类型：遗传型(家族型)ATTR淀粉样变性(hATTR)。此种类型的ATTR淀粉样变为显性遗传病。迄今为止，文献报道中已经描述了TTR基因上的140多种突变(Connors,L.H.；Lim,A.；Prokaeva,T.；Roskens,V.A.；Costello,C.E.,Tabulationof human transthyretin(TTR)variants,2003.Amyloid 2003,10(3),160
‑
84)。野生型 (wtATTR)ATTR淀粉样变性与遗传型ATTR淀粉样变性不同，野生型不涉及异常DNA，也不能遗传给家庭成员。相反，随着年龄的增长，正常的TTR蛋白变得不稳定，更易发生错误折叠并形成淀粉样原纤维(Sekijima,Y.,Transthyretin(ATTR)amyloidosis:clinical spectrum, molecularpathogenesis and disease
‑
modifying treatments.J Neurol Neurosurg Psychiatry2015,86(9),1036
‑
43))。
[0005]此外，ATTR还会导致患者的其他器官受累。其中，手臂受到影响的症状包括：腕管综合症、麻木，灼痛和/或刺痛(周围神经病变)、二头肌腱断裂；背部受到影响的症状包括：腰椎管狭窄症；腿部受到影响的症状包括：脚或腿肿胀、麻木，灼痛和/或刺痛(周围神经病变)、腿无力；头部和颈部受到影响的症状包括：眼部漂浮物(玻璃状混浊)、站立时头昏眼花；心脏和肺部受到影响的症状包括：气促、心悸、胸痛、疲劳；胃或肠受到影响的症状包括：没胃口、胀气腹泻或便秘。由于该疾病的高度受累率，ATTR通常会极大地影响患者的生活质量，独立性和预期寿命。如果不加以治疗，诊断后的预期寿命为2至5年。
[0006]目前，免疫浊度法是进行血液中TTR浓度测定的常用方法。该方法测定的是血液中总的 TTR浓度，包括TTR单体、二聚体、四聚体，是这三种浓度之和，不能特异性对TTR四聚体的浓度进行单独测定，也无法获得错误折叠的TTR的量，更无法区分TTR四聚体类型。因此迫切需要开发一种准确精密且特异性强的血液中TTR四聚体的检测方法。

技术实现思路

[0007]为克服现有技术中存在的缺陷，本专利技术针对TTR四聚体的特点，设计开发一种血液
中转甲状腺素蛋白(TTR)四聚体浓度测定的预处理方法和检测方法，该方法具有良好的选择性，精密度和准确度。可实现血液中TTR四聚体野生型或变异型的类型区分并对其浓度进行定量测定，并可通过TTR总浓度减去TTR四聚体浓度得出TTR错误折叠浓度，这对于携带显著不稳定、罕见或当前未表征的TTR突变的患者尤其有价值。为了实现上述技术效果，本专利技术提供如下的技术方案：
[0008]本专利技术的第一个方面，提供一种血液中转甲状腺素蛋白(TTR)四聚体浓度测定的预处理方法，所述预处理方法包括如下步骤：
[0009](1)血液过滤膜，加入小分子荧光探针，进行孵育；
[0010](2)加入稀释剂进行稀释；
[0011](3)离心，取上清液，作为待测液。
[0012]作为一种优选实施方式，所述滤膜为PVDF膜、Nylon滤膜、混合纤维素酯滤膜、聚丙烯滤膜、PES、PTFE滤膜，直径为0.22μm
‑
0.45μm。
[0013]在一种实施方式中，所述小分子荧光探针包括二苯乙烯类似物和含1,3,4
‑
恶二唑磺酰氟类似物。
[0014]作为一种优选实施方式，二苯乙烯类似物结构如下所示:
[0015][0016]作为一种优选实施方式，含1,3,4
‑
恶二唑磺酰氟类似物结构如下所示:
[0017][0018]作为一种优选实施方式，所述二苯乙烯类似物浓度为300μmol/L
‑
3mmol/L，二苯乙烯类似物和血液的体积比为1:(1
‑
20)。
[0019]在一种实施方式中，所述的孵育是通过鼓风干燥箱，恒温混匀仪或水浴锅进行，优选地，孵育温度为20
‑
30℃；孵育的时间为1
‑
3h。
[0020]在一种实施方式中，所述的稀释剂为初始流动相或pH为5
‑
10的PBS溶液，优选地，稀释剂与血液的体积比为(1
‑
10):1。
[0021]在一种实施方式中，步骤(3)中所述离心的离心力为10000
‑
15000g，时间为5
‑
15分钟，温度为4
‑
10℃。
[0022]本专利技术的第二个方面，提供一种血液中转甲状腺素蛋白(TTR)四聚体浓度测定的检测方法，该方法包括如下步骤：
[0023](1)按上述所述的预处理方法处理得到待测液；
[0024](2)采用高效液相色谱或超高效液相色谱进行分析，通过比对重组TTR四聚体色谱峰的保留时间与检测样本中TTR四聚体色谱峰的保留时间，对样本中的TTR四聚体进行定性，并通过校准曲线计算血液样本中TTR四聚体的浓度，将总TTR浓度减去TTR四聚体浓度得出错误折叠TTR浓度。
[0025]在一种实施方式中，所述的色谱柱为强阴离子交换柱或SEC色谱柱，柱温为30
‑
50℃，进样器温度为10
‑
20℃。
[0026]在一种实施方式中，所述的流动相A为含乙二胺四乙酸(EDTA)的Tris
‑
HCl缓冲体系，所述流动相B为含氯化钠(NaCl)和乙二胺四乙酸(EDTA)的Tris
‑
HCl缓冲体系；流动相流速0.3
‑
1mL/min；梯度洗脱；进样量：5
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血液中转甲状腺素蛋白(TTR)四聚体浓度测定的预处理方法，其特征在于，所述预处理方法包括如下步骤：(1)血液过滤膜，加入小分子荧光探针，进行孵育；(2)加入稀释剂进行稀释；(3)离心，取上清液，作为待测液。2.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤(1)中滤膜为PVDF膜、Nylon滤膜、混合纤维素酯滤膜、聚丙烯滤膜、PES、PTFE滤膜，直径为0.22μm
‑
0.45μm。3.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤(1)所述小分子荧光探针包括二苯乙烯类似物和含1,3,4
‑
恶二唑磺酰氟类似物，其中，小分子荧光探针浓度为300μmol/L
‑
3mmol/L，小分子荧光探针和血液的体积比为1:(1
‑
20)。4.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤(1)中孵育是通过鼓风干燥箱，恒温混匀仪或水浴锅进行，孵育温度为20
‑
30℃；孵育的时间为0.1
‑
3h。5.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤(2)中稀释剂为初始流动相或pH为5
‑
10的PBS溶液，稀释剂与血液的体积比为(1
‑
10):1。6.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤(3)中离心力为10000
‑
15000g，时间为5
‑
15分钟，温度为4
‑
10℃。7.一种血液中转甲状腺素蛋白(TTR)四聚体浓度测定的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：按权利要求1～6任一项所述的预处理方法处理得到待测液，采用高效液相色谱或超高效液相色谱进行分析，通...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宇，曹云峰，崔丽，关丽萍，刘明莉，崔雪婷，高鹏，
申请(专利权)人：大连润生康泰医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：