基于TF抗原和壳寡糖内源性佐剂的肿瘤疫苗、方法和应用技术

本发明专利技术公开一种由TF抗原和壳寡糖内源性佐剂共价偶联CRM197载体蛋白制备的肿瘤疫苗，所述合成肿瘤疫苗的结构式如下：免疫实验结果表明，本发明专利技术的偶联壳寡糖佐剂组(TF

【技术实现步骤摘要】
基于TF抗原和壳寡糖内源性佐剂的肿瘤疫苗、方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及基于Thomsen
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Friedenreich抗原和壳寡糖佐剂的肿瘤疫苗的制备和免疫学评价，尤其是一种基于TF(Thomsen
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Friedenreich)抗原和壳寡糖内源性佐剂的肿瘤疫苗、方法和应用。

技术介绍

[0002]肿瘤疫苗现已成为一种理想的肿瘤治疗方法，依据肿瘤细胞表面过量表达的结构
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肿瘤相关糖抗原(TACAs)设计并合成抗肿瘤疫苗，用来刺激人体的免疫系统，产生免疫应答，目的是为了使肿瘤的生长、繁殖和扩散受到抑制，最终杀死肿瘤。Thomsen
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Friedenreich(TF)抗原是非常重要的肿瘤靶点之一，它在结肠癌、乳腺癌、膀胱癌和胃癌中都存在过量表达。TF抗原是一种半抗原，其基本结构为Galβ1,3GalNAcαSer/Thr，是黏蛋白O
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寡糖链的Ⅰ型核心结构；TF抗原的前体物质是Tn抗原(GalNAcαSer/Thr)。然而，天然糖抗原并不能直接引起可产生高亲和力的IgG抗体的细胞免疫。为了解决这种糖疫苗的缺点，将糖抗原与载体蛋白偶联，制备出全抗原，并加入免疫佐剂，可制备出有效的疫苗。
[0003]对于糖类免疫佐剂，近年来研究发现多糖具有免疫佐剂的作用，可增强疫苗的免疫效果，能同时促进机体产生特异型免疫与非特异型免疫。因此，降解多糖制备功能性寡糖用作疫苗佐剂的研究也应运而生。壳寡糖(Chitooligosaccharides，COS)，又名壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是将壳聚糖经特殊的生物酶技术(或化学降解、微波降解技术)降解得到的一种聚合度在2～20之间寡糖产品，分子量≤3200Da，水溶性好，具有良好的生物相容性，并且其来源广泛、纯天然、易吸收，更为值得关注的是它能够有效激活机体细胞免疫和体液免疫，将其开发为疫苗佐剂具有良好的应用前景。据报道，Liu等将壳寡糖作为福尔马林灭活鳗弧菌疫苗的佐剂，能明显促进机体的体液免疫，有效的抑制病原菌的侵袭，进一步明确了壳寡糖作为佐剂的活性(Fish&shellfish immunology,2015,47:855
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860)。
[0004]目前，佐剂最常用的使用方法是与抗原直接物理混合。简单的物理混合虽然能有一定的免疫活性，但并不一定是发挥其佐剂活性的最佳方式。文献报道，将抗原和佐剂共存于一个递送系统中能增强免疫原性，如抗原和佐剂活性的鞭毛蛋白、CpG及LPS等(Bioconjugate Chem,2007,18:77
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83；Vaccine,2009,27:3013
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3021)。研究显示，只有当抗原递呈细胞(APC)呈递一定量的抗原和佐剂才能激活T细胞，只呈递其一并不能激活T细胞(Nature,2006,440:808
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812；Vaccine,2008,26:1626
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1637)。Sl
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tter等研究发现将抗原与佐剂化学偶联成一个整体APC才能呈递更多的抗原，进而激活T细胞的免疫应答。(Journal ofControlled Release,2010,143:207
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214)。因此，上述合成疫苗技术中存在物理混合抗原和佐剂不能达到同时递呈APC细胞的缺陷，本研究为解决该问题，本专利技术将TF糖抗原与载体蛋白共价偶联，并共价偶联引入壳寡糖作为免疫佐剂，设计并合成出新颖的基于Thomsen
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Friedenreich抗原和内源性壳寡糖佐剂的肿瘤疫苗。
[0005]通过检测，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的在于克服现有技术中存在的不足之处，提供一种以TF抗原和壳寡糖作为佐剂共价偶联白喉毒素突变体CRM197的肿瘤疫苗、方法和应用，并对其进行免疫学评价。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]一种由TF抗原和壳寡糖内源性佐剂共价偶联CRM197载体蛋白制备的肿瘤疫苗，所述肿瘤疫苗的结构式如下：
[0009][0010]进一步地，所述疫苗通过化学法合成得到TF
‑
己二酸琥珀酰亚胺酯，将其与白喉毒素突变体CRM197载体蛋白结合得到糖蛋白缀合物，缀合物与巯基化壳寡糖疫苗佐剂通过异型双功能连接臂偶联。
[0011]进一步地，所述巯基化壳寡糖疫苗佐剂中的巯基化剂为2
‑
亚氨基硫烷盐酸盐、巯基乙酸或3
‑
(2
‑
吡啶二巯基)丙酸N
‑
羟基琥珀酰亚胺酯；或者，所述异型双功能连接臂为3
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苯甲酰马来酰亚胺
‑
N
‑
羟基琥珀酰亚胺、3
‑
马来酰亚胺基丙酸、3
‑
马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯或4
‑
(N
‑
马来酰亚胺基甲基)环己烷
‑1‑
羧酸琥珀酰亚胺酯。
[0012]进一步地，所述巯基化壳寡糖疫苗佐剂与糖蛋白缀合物的重量比为0.3:1～0.6:1。
[0013]进一步地，所述疫苗为抗肿瘤疫苗。
[0014]一种如上述的肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0015]步骤一，化学法合成得到TF
‑
己二酸琥珀酰亚胺酯；
[0016]步骤二，将TF
‑
己二酸琥珀酰亚胺酯与白喉毒素突变体CRM197载体蛋白结合，两者的摩尔比为15:1～20:1，得到糖蛋白缀合物；
[0017]步骤三，将壳寡糖佐剂进行巯基化衍生，获得巯基化壳寡糖疫苗佐剂；
[0018]步骤四，将异型双功能连接臂与步骤二中制备的缀合物的以摩尔比8:1～10:1进行反应，获得中间体；
[0019]步骤五，将步骤三所得巯基化壳寡糖疫苗佐剂与步骤四的中间体反应，巯基化壳寡糖疫苗佐剂与中间体的重量比为0.3:1～0.6:1，获得目标偶联物；
[0020]步骤六，将步骤五所得偶联物超滤离心，经冻干操作，获得目标合成肿瘤疫苗。
[0021]进一步地，具体步骤如下：
[0022]步骤一，以半乳糖氨基盐酸盐为初始原料，糖环2位叠氮化，1位糖苷化和4，6位苯甲醛二甲缩醛保护初步得到糖基受体，糖基受体与硫苷糖基供体进行二糖糖苷化反应获得TF二糖，后经叠氮还原及脱保护和保护操作获得的TF抗原化合物，7步反应总收率12％，TF抗原与己二酸双琥珀酰亚胺酯以摩尔比12:1～15:1进行反应化，得到TF
‑
己二酸琥珀酰亚胺酯；
[0023]步骤二，将TF
‑
己二酸琥珀酰亚胺酯与白喉毒素突变体CRM197载体蛋白结合溶于PBS缓冲液中，两者的摩尔比为15:1～20:1，经过超滤离心纯化，得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种由TF抗原和壳寡糖内源性佐剂共价偶联CRM197载体蛋白制备的肿瘤疫苗，其特征在于：所述肿瘤疫苗的结构式如下：2.根据权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述疫苗通过化学法合成得到TF
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己二酸琥珀酰亚胺酯，将其与白喉毒素突变体CRM197载体蛋白结合得到糖蛋白缀合物，缀合物与巯基化壳寡糖疫苗佐剂通过异型双功能连接臂偶联。3.根据权利要求2所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述巯基化壳寡糖疫苗佐剂中的巯基化剂为2
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亚氨基硫烷盐酸盐、巯基乙酸或3
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(2
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吡啶二巯基)丙酸N
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羟基琥珀酰亚胺酯；或者，所述异型双功能连接臂为3
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苯甲酰马来酰亚胺
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N
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羟基琥珀酰亚胺、3
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马来酰亚胺基丙酸、3
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马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯或4
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(N
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马来酰亚胺基甲基)环己烷
‑1‑
羧酸琥珀酰亚胺酯。4.根据权利要求2和3所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述巯基化壳寡糖疫苗佐剂与糖蛋白缀合物的重量比为0.3:1～0.6:1。5.根据权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述疫苗为抗肿瘤疫苗。6.一种如权利要求1至5任一所述的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一，化学法合成得到TF
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己二酸琥珀酰亚胺酯；步骤二，将TF
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己二酸琥珀酰亚胺酯与白喉毒素突变体CRM197载体蛋白结合，两者的摩尔比为15:1～20:1，得到糖蛋白缀合物；...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟欣，孙宝莹，高航，张子健，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：