大黄鱼白细胞介素2基因启动子序列及其应用制造技术

大黄鱼白细胞介素2基因启动子序列及其应用，提供大黄鱼IL

【技术实现步骤摘要】
大黄鱼白细胞介素2基因启动子序列及其应用


[0001]本专利技术涉及白细胞介素2基因启动子，尤其是涉及大黄鱼白细胞介素2基因启动子序列及其应用。

技术介绍

[0002]白细胞介素2(Interleukin,IL
‑
2)是一种多效性细胞因子，可调节CD4
+
T淋巴细胞的发育和分化、促进B淋巴细胞增殖和抗体产生，被认为在调控抗病原感染的免疫应答中发挥重要作用(Gaffen S,Liu KD,Overview of interleukin
‑
2function,production and clinicalapplications[J],2004,Cytokine,28(3):109
‑
123)。在前期研究中，从大黄鱼脾脏组织中克隆大黄鱼白细胞介素2基因(IL
‑
2)的全长cDNA序列，在毕赤酵母中完成其去信号肽片段的重组表达与纯化，证实其可在大黄鱼体内诱导大黄鱼脾脏、肾脏中与T淋巴细胞发育与分化相关的细胞因子及转录因子表达上调，说明大黄鱼IL
‑
2可能参与T淋巴细胞的发育与分化(Mu P,Wang Y,Ao J,et al.Molecular cloning and bioactivity of an IL
‑
2homologue in large yellow croaker(Larimichthyscrocea)[J].Fish Shellfish Immunology.2018,81:309
‑
317)。在此基础上，为研究大黄鱼IL
‑
2基因的表达调控机制，从大黄鱼基因组中进一步克隆IL
‑
2基因的5
’
侧翼启动子序列，经报告基因检测实验证实该启动子序列具有较强的启动子活性。免疫刺激物LPS、Poly(I:C)对其活性影响不大，但T细胞活化剂PHA、Con
‑
A、CI、PMA等可刺激IL
‑
2基因启动子活性显著上调。大黄鱼IL
‑
2启动子序列的克隆和活性验证，在理论上将为研究IL
‑
2基因的表达调控机理提供良好的实验系统，在应用方面为利用该启动子构建表达载体高效表达外源基因或将其应用于转基因鱼构建创造条件，具有重要的理论和实际意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术的第一目的在于提供大黄鱼IL
‑
2基因启动子的序列。
[0004]本专利技术的第二目的在于提供一种大黄鱼IL
‑
2基因启动子的活性分析方法。
[0005]本专利技术的第三目的在于提供一种大黄鱼IL
‑
2基因启动子的应用。
[0006]所述大黄鱼IL
‑
2基因启动子的序列为：
[0007][0008]所述一种大黄鱼IL
‑
2基因启动子的活性分析方法包括以下步骤：
[0009]1)采用Clontech绿色荧光蛋白表达系统对该启动子活性进行定性分析，采用Promega公司双荧光素酶报告基因检测系统对该启动子活性进行定量分析，并分析免疫刺激物大肠杆菌脂多糖LPS、人工合成双链RNA Poly(I:C)以及T细胞活化剂植物凝集素PHA、刀豆蛋白Con
‑
A、钙离子霉素CI、佛波酯PMA等对其活性的影响；
[0010]2)将大黄鱼IL
‑
2基因启动子区片段插入Clontech公司绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP1中，使绿色荧光蛋白基因位于该启动子的控制下，得到重组表达载体pEGFP1
‑
IL2P，将该重组载体转染鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)中，45～50h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况；
[0011]3)将大黄鱼IL
‑
2基因启动子序列插入Promega公司荧光素酶报告基因载体pGL3
‑
Basic中，使萤火虫荧光素酶基因位于该启动子的控制下，得到重组表达载体pGL3
‑
IL2P；用pGL3
‑
IL2P和海肾荧光素酶报告基因载体pRL
‑
TK共转染鲤鱼EPC细胞，45～50h后收集转染细胞；利用双荧光素酶报告基因检测系统分别检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的酶活性值，通过计算二者酶活性值的比值得出转染细胞中荧光素酶的相对活性；
[0012]4)以空载体pGL3
‑
Basic和海肾荧光素酶报告基因载体pRL
‑
TK共转染人Jurkat
‑
T细胞的荧光素酶相对活性作为对照，计算出该启动子的相对活性；再用PBS、LPS、Poly(I:C)、PHA、Con
‑
A、CI、PMA及CI+PMA刺激pGL3
‑
IL2P和pRL
‑
TK共转染的Jurkat
‑
T细胞，通过分析各处理组荧光素酶相对活性的变化，确定大黄鱼IL
‑
2基因启动子的活性是否受刺激物诱导的影响。
[0013]所述大黄鱼IL
‑
2基因启动子的克隆及其启动子活性的鉴定，可在构建大黄鱼IL
‑
2基因的表达调控机制实验系统中应用。
[0014]所述大黄鱼IL
‑
2基因启动子可用于构建重组真核表达载体在鱼类或哺乳类细胞中高效表达外源基因中应用。
[0015]所述大黄鱼IL
‑
2基因启动子可在构建转基因鱼中应用。
[0016]本专利技术具有以下突出优点和技术效果：
[0017]本专利技术采用基因组步移的方法从大黄鱼基因组中扩增克隆大黄鱼IL
‑
2基因启动子，提供大黄鱼IL
‑
2基因启动子序列，并证实其启动子活性；经报告基因分析实验证明该大
黄鱼IL
‑
2基因启动子可在鲤鱼上皮瘤细胞EPC中启动绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶基因的表达；该启动子在人Jurkat
‑
T细胞中可被T细胞活化剂PHA、Con
‑
A、CI及PMA诱导激活，但不能被免疫刺激剂LPS及Poly(I：C)诱导激活。因此，该大黄鱼IL
‑
2基因启动子的克隆及其强启动子活性的鉴定，在理论上将为研究大黄鱼IL
‑
2基因的表达调控机制提供良好的实验系统，在应用方面为利用该启动子构建重组表达载体高效表达外源基因或将该启动子应用于转基因鱼构建创造条件，具有重要的理论和实际意义。
附图说明
[0018]图1为采用绿色荧光蛋白表达系统定性分析大黄鱼IL
‑
2基因启动子的活性。将重组表达载体pEGFP1
‑
IL2P转染鲤鱼上皮瘤EPC细胞，48h后观察绿色荧光蛋白表达情况。Green表示荧光显微镜观察结果，Br本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大黄鱼IL
‑
2基因启动子，其特征在于其序列为：2.如权利要求1所述大黄鱼IL
‑
2基因启动子的活性分析方法，其特征在于包括以下步骤：1)采用Clontech公司绿色荧光蛋白表达系统以及Promega公司双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子的活性，并分析免疫刺激物大肠杆菌脂多糖LPS、人工合成双链RNAPoly(I:C)、T细胞活化剂植物凝集素PHA、刀豆蛋白Con
‑
A、钙离子霉素CI、佛波酯PMA对其活性的影响；2)将大黄鱼IL
‑
2基因启动子区片段插入Clontech公司绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP1中，使绿色荧光蛋白基因位于该启动子的控制下，得到重组表达载体pEGFP1
‑
IL2P，将该重组载体转染鲤鱼上皮瘤细胞(EPC细胞)，45～50h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况；3)将大黄鱼IL
‑
2基因启动子序列插入Promega公司荧光素酶报告基因载体pGL3
‑
Basic中，使萤火虫荧光素酶基因位于该启动子的控制下，构建得到重组载体pGL3
‑
IL2P；用pGL3
‑
IL2P和海肾荧光素酶报告基因载体pRL
‑
TK共同转染EPC细胞，45～50h后收集转染细胞，利用双荧光素酶报告基因检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：敖敬群，慕鹏飞，汪玉华，陈新华，
申请(专利权)人：自然资源部第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：