一种强活性的水稻启动子序列及验证方法技术

本发明专利技术公开了一种强活性的水稻启动子序列及验证方法，基因序列如SEQ ID NO.1。方法包括：(1)OsUBQ启动子序列扩增，构建OsUBQ驱动GFP的表达载体；(2)Ubi1启动子序列扩增，构建由Ubi1驱动的GFP表达载体；(3)使用CaMV35S启动子为正对照；(4)水稻原生质体制备与转化；(5)在瞬时表达系统通过荧光强度评估三个启动子CaMV35S、OsUBQ和Ubi1活性。本发明专利技术的水稻启动子序列，本质是DNA分子，1405bp，能够启动基因的表达并且活性更强。因的表达并且活性更强。因的表达并且活性更强。

【技术实现步骤摘要】
一种强活性的水稻启动子序列及验证方法


[0001]本专利技术涉及启动子及验证方法，特别涉及一种强活性的水稻启动子序列及验证方法。

技术介绍

[0002]植物启动子在转录水平上对基因的表达调控起着非常重要的作用。大多数启动子位于基因5
’
端转录起始位点上游。启动子序列包含基因转录所需的RNA聚合酶复合物的结合位点及转录因子结合位点，当基因被调控表达时，这些位点能够被转录因子特异性识别和结合，进而招募RNA聚合酶组装成复合体，启动子决定起始位置和转录的方向。研究表明，大多数启动子位于染色体上的开放染色质区域。在基因工程研究中，启动子是影响外源转基因表达效率的重要因素之一。实践上需要高效的启动子用于驱动外源基因表达，以便在转基因植株中获得较好的农艺性状。因此，组成型表达的强启动子具有较广的应用前景。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：本专利技术目的是提供一种强活性的水稻启动子序列。
[0004]本专利技术另一目是提供所述强活性的水稻启动子序列的验证方法。
[0005]技术方案：本专利技术提供一种强活性的水稻启动子序列，基因序列如SEQ ID NO.1。
[0006]进一步地，用引物以粳稻日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonica var.Nipponbare)的基因组DNA为模板，扩增得到1405bp的扩增产物，即SEQ ID NO.1。
[0007]进一步地，所述引物序列如下：
[0008]正向F：5
’‑
>CTGCAAATACTGCAAAGAAT
‑3’
；
[0009]反向R：5
’‑
AAGAGGCGAGGAGGGGGTGG
‑3’
。
[0010]进一步地，
[0011]所述的水稻启动子活性检测的具体方法，如下：
[0012]1)LOC_Os06g46770基因在各个组织中表达量较高，为组成型表达。在它的转录起始位点上游的1405bp序列，定义为启动子序列OsUBQ(SEQ ID NO.1)。
[0013]2)为验证OsUBQ启动子活性，构建OsUBQ驱动GFP的表达载体。
[0014]3)已发表的该基因Ubil启动子序列与本实验中预测的启动子之间的序列分析。
[0015]4)Ubi1启动子序列扩增，构建由Ubi1驱动的GFP表达载体。
[0016]5)使用CaMV35S启动子为正对照。
[0017]6)水稻原生质体制备与转化。
[0018]7)在瞬时表达系统评估三个启动子CaMV35S、OsUBQ和Ubi1活性。
[0019]鉴定原理：
[0020]研究发现大多数启动子位于染色体上的开放染色质区域。通常启动子位于基因转录起始位点上游。利用启动子的位置特征和开放染色质图谱可以有效预测基因的启动子区。本专利技术中发现LOC_Os06g46770基因的启动子OsUBQ，在瞬时表达体系中其活性较强，强
于与已发表的Ubi1启动子。
[0021]有益效果：本专利技术的水稻启动子序列，本质是DNA分子，1405bp，能够启动基因的表达并且活性更强。
附图说明
[0022]图1 LOC_Os06g46770基因结构示意图；
[0023]图2瞬时表达系统检测三个启动子CaMV35S、OsUBQ和Ubil活性。
具体实施方式
[0024]本实施例的启动子获取及鉴定方法如下：
[0025]1.LOC_Os06g46770启动子介绍
[0026]LOC_Os06g46770基因编码泛素蛋白，该基因在茎、叶、花序、根等组织中表达较强，呈现组成型表达特点。从植物PlantDHS(http：//plantdhs.org/)数据库中获得水稻开放染色质(DNase
‑
seq)数据，依据开放染色质特征预测该基因的启动子序列。在该基因的转录起始位点上游，约1.4kb的区间内存在2个开放染色质位点，图1所示。因此克隆这段DNA序列(1405bp，SEQ ID NO.1)并命名为OsUBQ启动子作为后续实验分析。
[0027]设计序列特异性引物，制备如下引物：
[0028]正向F：5
’‑
CTGCAAATACTGCAAAGAAT
‑3’
；
[0029]反向R：5
’‑
AAGAGGCGAGGAGGGGGTGG
‑3’
。
[0030]用以上引物以粳稻日本晴的基因组DNA为模板，扩增得到1405bp的扩增产物。经测序，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的自5
’
端第一位至1045位所示。
[0031]2.载体构建
[0032]查阅文献得知，已有研究报道过LOC_Os06g46770基因的启动子并命名为Ubi1启动子，文献如下：Bhattacharyya，J.，Chowdhury，A.H.，Ray，S.et al.Native polyubiquitin promoter of rice provides increased constitutive expression in stable transgenic rice plants.Plant Cell Rep 31，271
‑
279(2012).
[0033]经过生物信息学分析，发现本实验中使用的OsUBQ启动子与已发表的Ubi1启动子在序列上不同，OsUBQ启动子序列为基因转录起始位点上游1405bp，包含两个开放染色质位点。Ubi1启动子长度为1537bp，包括基因转录起始位点上游683bp序列(此区域仅有一个开放染色质位点)和转录起始位点下游的854bp序列(这段序列有5
’
UTR和内含子)。在本实验中分别构建上述两个启动子的检测载体，具体操作如下：
[0034]2.1骨架载体的准备
[0035]GFP报告基因载体由电子科技大学张勇课题组提供。用Xba I和Asc I限制性内切酶切除掉原有的启动子序列得到线性化的骨架载体。
[0036]2.2启动子序列的扩增
[0037]本实验中预测的OsUBQ启动子序列用如下引物扩增：
[0038]正向F：5
’‑
CTGCAAATACTGCAAAGAAT
‑3’
；
[0039]反向R：5
’‑
AAGAGGCGAGGAGGGGGTGG
‑3’
。
[0040]Ubi1启动子序列用如下引物扩增：
[0041]正向F：5
’‑
CACATCAGTCTCTGCACAAA
‑3’
；
[0042]反向R：5
’‑
CTGCACACACAATTACCGAA
‑3’
。
[0043]本实验用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种强活性的水稻启动子序列，基因序列如SEQ ID NO.1。2.根据权利要求1所述的强活性的水稻启动子序列，其特征在于：用引物以粳稻日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonica var.Nipponbare)的基因组DNA为模板，扩增得到1405bp的扩增产物，即SEQ ID NO.1。3.根据权利要求2所述的强活性的水稻启动子序列，其特征在于：所述引物序列如下：正向F：5
’‑
CTGCAAATACTGCAAAGAAT
‑3’
；反向R：5
’‑
AAGAGGCGAGGAGGGGGTGG<...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹏，张韬，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：