干扰U2AF2基因的shRNA及其在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了干扰U2AF2基因的shRNA及其在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术通过实验确定U2AF2在三阴性乳腺癌组织中的高表达水平，为乳腺癌的靶向治疗提供了作用靶点，通过设计靶向抑制U2AF2基因的siRNA序列、以及相应的siRNA表达质粒和shRNA慢病毒，高效抑制U2AF2在人三阴性乳腺癌细胞耐药细胞中的表达，并显著增强该细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性。本发明专利技术对于制备抑制三阴性乳腺癌细胞耐药的药物具有重大意义。义。义。

【技术实现步骤摘要】
干扰U2AF2基因的shRNA及其在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，更具体地说，涉及一种干扰U2AF2基因的shRNA及其在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用。

技术介绍

[0002]2020年最新癌症数据显示乳腺癌已成为全球第一大癌，且是女性癌症死亡的第一大原因。尽管近年来乳腺癌综合治疗已取得了进展，但是转移和复发仍然是提高患者生存率的主要障碍，尤其是在预后较差的三阴性乳腺癌(Triple
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negative breast cancer，TNBC)中显得尤为突出。TNBC约占乳腺癌的15％
‑
20％，因缺乏ER、PR及HER
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2受体，导致内分泌治疗及靶向治疗无法进行，化疗仍是最主要的治疗手段。但棘手的是仅有20％的TNBC患者对标准化疗方案敏感，且相当一部分患者极易出现化疗耐药。因此，靶向TNBC化疗耐药的关键基因是提高患者生存率的重要举措。
[0003]可变剪切调节因子U2AF2(又称为U2AF65)，分子量为65KD，在选择性剪切过程中调节U2 snRNP与前mRNA结合。可变剪接的错误调节与肿瘤的发生发展密切相关，比如U2AF2高表达，与肺癌、肝癌的不良预后呈正相关。但U2AF2在乳腺癌尤其是在三阴性乳腺癌中的表达及功能尚未见任何报道。
[0004]目前研究报道的抑制U2AF2基因的方法仅有基因敲除，但该方法研究周期长、对技术条件的要求高且难以应用于临床治疗，因而存在明显的局限性。核糖核酸干扰(RNA interference，RNAi)是近年来广泛应用的一种基因沉默技术，其通过一种特定的由21个碱基组成的小干扰核糖核酸(short interfering RNA，siRNA)，可简便、高效、特异地阻断体内特定基因的表达，使细胞表现出相应基因表型的缺失，从而在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研究与开发等方面得到了较多的应用。但由于siRNA片段的半衰期过短，体外合成的siRNA片段转移到细胞内后，其发挥出的基因抑制作用一般是很短暂的。因此，临床研究中一般采取事先在体外构建能够表达siRNA片段的载体，再将载体转移至细胞内使其表达出siRNA片段的策略。目前常用的载体包括逆转录病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒表达载体相对于其它表达载体，具有免疫原性低、感染效率高、感染时效长、感染效果稳定且能感染分裂相和非分裂相细胞等优点。目前，慢病毒载体已发展到了临床实验阶段，成为肿瘤治疗领域中应用技术研发的强有力手段。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供干扰U2AF2基因的shRNA，能有效地干扰U2AF2基因在细胞中的表达。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供干扰U2AF2基因的shRNA在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0007]一种干扰U2AF2基因的shRNA，含有靶点序列为：
[0008][0009]进一步地，所述的干扰U2AF2基因的shRNA，其核酸序列如下：
[0010]正义链：
[0011][0012]反义链：
[0013][0014]含有所述的干扰U2AF2基因的shRNA的载体。
[0015]进一步地，所述的载体是GV298。
[0016]一种重组慢病毒，含有编码所述干扰U2AF2基因的shRNA的核酸序列。
[0017]所述干扰U2AF2基因的shRNA或所述的含有干扰U2AF2基因的shRNA的载体或所述的重组慢病毒在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用。
[0018]进一步地，所述的抗三阴性乳腺癌药物是提高三阴性乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的药物。
[0019]进一步地，所述的抗三阴性乳腺癌药物是抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭能力的药物。
[0020]进一步地，所述的抗三阴性乳腺癌药物是抑制三阴性乳腺癌细胞迁移能力的药物。
[0021]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0022]本专利技术通过免疫组织化学染色检测U2AF2在人乳腺癌组织中的表达，证明U2AF2在乳腺癌组织中高表达，且与化疗用药密切相关。本专利技术进一步设计人U2AF2基因的siRNA序列，并构建相应的siRNA质粒和shRNA慢病毒，通过U2AF2的shRNA干扰的慢病毒转染人三阴性乳腺癌耐药细胞后，实验证实细胞对紫杉醇的敏感性显著提高，说明U2AF2是三阴性乳腺癌耐药的关键基因，且U2AF2 shRNA慢病毒能显著抑制其化疗耐药性，具有作为治疗抗三阴性乳腺癌药物的巨大潜力。
附图说明
[0023]图1是免疫组化检测U2AF2在人三阴性乳腺癌组织中的表达结果图；
[0024]图2是Wcsternblot检测U2AF2在人三阴性乳腺癌细胞中的表达结果图；
[0025]图3是U2AF2在正常乳腺上皮细胞、三阴性乳腺癌细胞及三阴性乳腺癌耐药细胞中的表达图；
[0026]图4是GV289质粒DNA图谱图；
[0027]图5是Helper1.0慢病毒包装辅助质粒结构图；
[0028]图6是Helper2.0慢病毒包装辅助质粒结构图；
[0029]图7是慢病毒感染细胞后的结果，空载对照慢病毒(sh
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U2AF2 NC)和U2AF2干扰慢病毒(sh
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U2AF2)感染人三阴性乳腺癌耐药细胞系(MDA
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MB
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231/PTX)的明视野及荧光视野图；
[0030]图8是sh
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U2AF2慢病毒感染MDA
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MB
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231/PTX细胞，Westemblot检测sh
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U2AF2干扰效率图；
[0031]图9是sh
‑
U2AF2慢病毒感染MDA
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MB
‑
231/PTX细胞后，细胞对紫杉醇IC50的变化结果图；
[0032]图10是U2AF2干扰后，MDA
‑
MB
‑
231/PTX细胞侵袭能力显著下降结果图；
[0033]图11是U2AF2干扰后，MDA
‑
MB
‑
231/PTX细胞迁移能力显著下降结果图。
具体实施方式
[0034]下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。
[0035]实施例1：
[0036]1、免疫组化检测U2AF2在三阴性乳腺癌及癌旁组织中的表达
[0037]1)经病理诊断为三阴性乳腺癌的石蜡标本及相应的癌旁组织标本进行常规切片。
[0038]2)组织石蜡切片脱蜡至水：石蜡切片置于烘箱60℃1小时，二甲苯I、II，各10分钟，梯度酒精：100％酒精2分钟、95％酒精2分钟、80％酒精2分钟、70％酒精2分钟，蒸馏水洗：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干扰U2AF2基因的shRNA，其特征在于，所述shRNA含有靶点序列为：5
′‑
CGCCTTCTGTGAGTACGTGGA
‑3′
。2.根据权利要求1所述的干扰U2AF2基因的shRNA，其特征在于，其核酸序列如下：正义链：5
′‑
CcggcgCCTTCTGTGAGTACGTGGACTCGAGTCCACGTACTCACAGAAGGCGTTTTTg
‑3′
；反义链：5
′‑
GATCCAAAAAcgCCTTCTGTGAGTACGTGGACTCGAGTCCACGTACTCACAGAAGGCG
‑3′
。3.含有权利要求1或2所述的干扰U2AF2基...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱红燕，郭显林，张素青，沈爱国，
申请(专利权)人：南通市肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：