群体感应淬灭内酯酶的稳定突变体及其在病原体的治疗中的用途制造技术

提供了突变型磷酸三酯酶样内酯酶或其功能性片段、以及编码它们的核酸分子和载体。此外，除了表达所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶的细胞和生产它们的方法以外，提供了治疗或预防例如植物或其一部分、器官或植物繁殖材料等宿主中的细菌感染的方法，所述方法包括向其施用所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶或野生型酶。所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶或野生型酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】群体感应淬灭内酯酶的稳定突变体及其在病原体的治疗中的用途


[0001]本专利技术总体上涉及群体感应依赖性细菌感染的管理，特别地涉及火疫病(fire blight)和其它植物病害的管理。

技术介绍

[0002]由病原体通过群体感应调节系统导致的疾病给临床和农业环境带来巨大挑战。例如，作为影响蔷薇科(family Rosaceae)的苹果、梨、和一些其它成员的、由解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)导致的接触传染病的火疫病的有效管理是多方面的并且主要为预防性的，利用环境卫生(sanitation)、培养实践(culturing practice)、铜杀虫剂、包含利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)作为活性成分的产品、和抗生素(例如，链霉素或土霉素)的预防性应用的组合(1)。
[0003]可通过群体感应调节系统在各种作物中导致疾病的常见植物病原体的其它实例为胡萝卜软腐坚固杆菌(Pectobacterium carotovorum)(2)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(3)、和皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugate)(4)，其感染马铃薯(Solanum tuberosum L.)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、和番茄(Lycopersicon esculentum)。作为依赖于群体感应调节系统的机会病原体的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是植物病原体并且是囊性纤维化患者和免疫妥协个体中发病率和死亡率的主要原因。
[0004]然而，调节限制、公共卫生问题、和抗性发展严重限制了抗生素和其它试剂的长期使用前景(5)。
[0005]因此，存在对于火疫病和其它衰弱性植物病害的有效试剂和管理的未满足的需求。

技术实现思路

[0006]在一方面，本专利技术提供包含突变的磷酸三酯酶样内酯酶的突变型磷酸三酯酶样内酯酶、或其功能性片段，其中在具有与SEQ ID NO:1为至少30％同一性的氨基酸序列中、对应于SEQ ID NO:1的位置59或172的氨基酸残基被置换，其中对应于G59的甘氨酸残基由选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸的氨基酸残基置换，或对应于H172的组氨酸残基由选自酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的氨基酸残基置换，并且所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶具有与野生型磷酸三酯酶样内酯酶为实质上相同的TIM桶状折叠和在其活性位点中保留的催化残基。
[0007]在另一方面，本专利技术提供包含如上定义的突变型磷酸三酯酶样内酯酶的组合物。
[0008]在额外的方面，本专利技术提供治疗或预防植物或其一部分、器官或植物繁殖材料中的细菌感染的方法，所述植物由分泌选自以下的内酯的细菌感染或易于受到分泌选自以下的内酯的细菌的感染：N
‑
(3
‑
羟基丁酰基)
‑
L
‑
高丝氨酸内酯(C4
‑
HSL)、N
‑
(3
‑
氧代
‑
己酰基)
‑
高丝氨酸内酯(C6
‑
氧代
‑
HSL)、N
‑
[(3S)
‑
四氢
‑2‑
氧代
‑3‑
呋喃基]辛酰胺(C8
‑
氧代
‑
HSL)、和
N
‑
[(3S)
‑
四氢
‑
呋喃基]癸酰胺(C10
‑
HSL)，所述方法包括对所述植物或其所述一部分、器官或植物繁殖材料施用具有与来自结核分枝杆菌(M.tuberclorosis)的野生型推定对硫磷水解酶(putative parathion hydrolase,PPH；SEQ ID NO:1)为至少30％同一性、具有与野生型推定对硫磷水解酶为实质上相同的TIM桶状折叠和在其活性位点中保留的催化残基的磷酸三酯酶样内酯酶、或其功能性片段，或者如上定义的突变型磷酸三酯酶样内酯酶或如上定义的组合物的任一种。
[0009]还在额外的方面，本专利技术提供一种分离的核酸分子，其包括编码如上定义的突变型磷酸三酯酶样内酯酶的核酸序列。
[0010]仍在额外的方面，本专利技术提供一种表达载体，其包括本专利技术的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接至启动子。
[0011]仍在另一方面，本专利技术提供一种细胞，其包括如上定义的分离的核酸分子或表达载体。
[0012]还在另一方面，本专利技术涉及生产如上定义的突变型磷酸三酯酶样内酯酶、或其功能性片段的方法，所述方法包括：(i)培养上述公开的实施方案的任一者的细胞；和(ii)从所述细胞分离所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶，从而获得突变型磷酸三酯酶样内酯酶。
[0013]在进一步的方面，本专利技术提供至少部分地由如上定义的组合物覆盖或涂布的植物或其一部分、器官或植物繁殖材料。
附图说明
[0014]图1A
‑
B显示了来自结核分枝杆菌(M.tuberclorosis)的推定对硫磷水解酶(PPH)的生物化学特征。PPH在大肠杆菌
‑
BL21(DE3)中重组表达，接着是使用直链淀粉柱的纯化步骤并用c6
‑
氧代
‑
HSL(25℃下E0＝0.01μM)分析PPH活性。使用pH指示剂甲酚紫、通过它们的羧酸产物的释放来监测c6
‑
氧代
‑
HSL的水解。(a)发现PPH在一定温度范围内为活性的；用硫代丁酰丁内酯(TBBL)(6)(thiobutyryl butyrolactone)测试活性。其最佳活性为40℃，并且其保持其活性的80％直至50℃。K
M
值为0.056
±
0.009mM，10.16
±
0.01s
‑1，k
cat
/K
M
为1.81*105s
‑1/M
‑1(b)。
[0015]图2A
‑
D显示了PPH进化变体表现与C6
‑
氧代HSL的增加的活性、增加的热稳定性和改善的保存期限。(a)由TBBL作为底物筛选PPH的文库，接着是45℃下的细菌裂解物培养。将热培养后具有最高活性的变体用于大规模生产和纯化。变体携带以下突变：变体PPH_R2:P4
‑
D5中G58V和变体PPH_R2:P8
‑
D12中H171Y，在PPH_R2:P4
‑
D5的情况中表现3.70*105s
‑1M
‑1的高催化活性k
cat
/K
M
，其是野生型酶的2倍以上，PPH_R2:8
‑
D12的k
cat
/K
M
为9.67*104s
‑1/M
‑1。(b)两种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种突变型磷酸三酯酶样内酯酶，其包括突变的野生型磷酸三酯酶样内酯酶、或其功能性片段，其中在具有与SEQ ID NO:1为至少30％同一性的氨基酸序列中、对应于SEQ ID NO:1的位置59或172的氨基酸残基被置换，其中对应于G59的甘氨酸残基由选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸的氨基酸残基置换，或对应于H172的组氨酸残基由选自酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的氨基酸残基置换，和所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶具有与野生型磷酸内酯酶样内酯酶实质上相同的TIM桶状折叠和在其活性位点中保留的催化残基。2.根据权利要求1所述的突变型磷酸三酯酶样内酯酶，其中对应于SEQ ID NO:1的G59的甘氨酸残基由缬氨酸置换。3.根据权利要求2所述的突变型磷酸三酯酶样内酯酶，其包含SEQ ID NO:2中记载的氨基酸序列或基本上由SEQ ID NO:2中记载的氨基酸序列组成。4.根据权利要求1所述的突变型磷酸三酯酶样内酯酶，其中对应于SEQ ID NO:1的H172的组氨酸残基由酪氨酸置换。5.根据权利要求4所述的突变型磷酸三酯酶样内酯酶，其包含SEQ ID NO:3中记载的氨基酸序列或基本上由SEQ ID NO:3中记载的氨基酸序列组成。6.根据权利要求1所述的突变型磷酸三酯酶样内酯酶，其还包含标签。7.根据权利要求1所述的突变型磷酸三酯酶样内酯酶，其中所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶与非突变的野生型磷酸三酯酶样内酯酶的热稳定性相比，具有增加的热稳定性，或与所述非突变型磷酸三酯酶样内酯酶相比，具有由N
‑
(3
‑
氧代
‑
己酰基)
‑
高丝氨酸内酯作为底物提供的实质上相似或更高的内酯酶催化活性。8.根据权利要求7所述的突变型磷酸三酯酶样内酯酶，其中表示为T
50
的所述增加的热稳定性为约50℃至约80℃，例如约65℃。9.根据权利要求7或8所述的突变型磷酸三酯酶样内酯酶，其与所述非突变型磷酸三酯酶样内酯酶相比，具有延长的保存期限。10.根据权利要求1所述的突变型磷酸三酯酶样内酯酶，其中对应于SEQ ID NO:1的G59的甘氨酸残基由缬氨酸置换、或对应于SEQ ID NO:1的H172的组氨酸残基由酪氨酸置换；和所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶与非突变的野生型磷酸三酯酶样内酯酶的热稳定性相比，具有增加的热稳定性，或与所述非突变型磷酸三酯酶样内酯酶相比，具有由N
‑
(3
‑
氧代
‑
己酰基)
‑
高丝氨酸内酯作为底物提供的实质上相似或更高的内酯酶催化活性。11.根据权利要求10所述的突变型磷酸三酯酶样内酯酶，其包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中记载的氨基酸序列或基本上由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中记载的氨基酸序列组成；表示为T
50
的所述增加的热稳定性为约55℃至约80℃，例如约65℃，或所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶与所述非突变型磷酸三酯酶样内酯酶相比，具有延长的保存期限。12.一种组合物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的突变型磷酸三酯酶样内酯酶。13.根据权利要求12所述的组合物，其还包含铜盐，例如，CuSO4。14.一种治疗或预防植物或其一部分、器官或植物繁殖材料中的细菌感染的方法，所述植物由分泌选自以下的内酯的细菌感染或易受到分泌选自以下的内酯的细菌的感染：N
‑
(3
‑
羟基丁酰基)
‑
L
‑
高丝氨酸内酯(C4
‑
HSL)、N
‑
(3
‑
氧代
‑
己酰基)
‑
高丝氨酸内酯(C6

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：米加尔加利里研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：