一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体制造技术

本发明专利技术属于酶工程技术领域，公开了一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体。该突变体具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或该突变体是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的保守性变异体。本发明专利技术提供的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体的比酶活是野生型的3.3倍，可以广泛应用于真菌毒素玉米赤霉烯酮的酶降解。玉米赤霉烯酮的酶降解。玉米赤霉烯酮的酶降解。

【技术实现步骤摘要】
一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体


[0001]本专利技术属于生物
，具体而言，涉及一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其编码基因，以及其在水解玉米赤霉烯酮中的应用。

技术介绍

[0002]玉米赤霉烯酮(Zearalenone，简称ZEN)，又称F
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2毒素，最初是从患赤霉病的玉米中分离得到的，是可以由许多镰孢属物种产生的一种非甾体雌激素霉菌毒素，作物在收获前后都会产生。玉米赤霉烯酮总是在包括玉米、大麦、小麦等许多作物和谷类副产品中被发现，尤其是在适合真菌生长的环境中。
[0003]ZEN作为世界上污染粮食最广泛的真菌毒素之一，在世界各地的谷物及其副产品中都检测到了ZEN。ZEN具有分布广、繁殖快、毒性大等特点，能够通过污染农作物进而危害人和动物的生命健康。ZEN的化学结构类似于天然雌激素，因此能够竞争性地结合雌激素受体，引起外部和内部生殖器改变和繁殖障碍，导致高雌性激素症和不孕症，此类毒素还会刺激乳腺癌细胞系的生长并在小鼠中致癌。
[0004]鉴于此类毒素的危害，大部分国家对粮食或饲料中的ZEN含量制定了严格标准。由于ZEN的稳定性较高，使用传统的物理和化学方法去除此类毒素的效率极低。为了解决该问题，酶降解成为降低此类毒素污染的一个有希望的策略。酶降解不仅可以高效地将毒素转化为无毒性产物，安全环保，而且酶催化反应专一性强、降解效率高，不会破坏谷物的营养物质。
[0005]迄今为止，已经有一些对于玉米赤霉烯酮降解酶的研究，得到了一些可以降解ZEN毒素的酶，它们能够特异性地结合ZEN并且降解它。本专利技术人曾研究获得了三种玉米赤霉烯酮降解酶，如CN107099520A公开了一种玉米赤霉烯酮降解酶Zhd518，CN108085306A公开了一种玉米赤霉烯酮降解酶ZhdAY3及其突变体，本专利技术人曾发表的论文(Wang M,Yin L,Hu H,Nimal S J,Zhou Y,&Zhang G.Expression,functional analysis and mutation of a novel neutral zearalenone
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degrading enzyme[J].International Journal of Biological Macromolecules,2018,118:1284
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1292.)，通过结构分析获得了突变体Zhd518(N156H)，简称为突变体1M，对于底物玉米赤霉烯酮的酶活是野生型的1.18倍。然而，以上所得玉米赤霉烯酮降解酶的比酶活仍然不够理想。

技术实现思路

[0006]鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种与中性玉米赤霉烯酮降解酶的比酶活提高显著关联的突变位点，以及一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其编码基因，以及其在水解玉米赤霉烯酮中的应用。
[0007]为了实现本专利技术的目的，专利技术人通过大量试验研究并不懈努力，最终在玉米赤霉烯酮降解酶突变体1M的基础上，采用定点突变技术获得编码突变体的基因，随后将编码突变体的基因位点进行重组表达，获得了一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变
体。具体地，本专利技术的技术方案概况如下：
[0008]一种突变位点在提高玉米赤霉烯酮降解酶突变体1M的比酶活中的应用，所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体1M的氨基酸序列如有SEQ ID NO.6所示，所述突变位点位于所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体1M的144氨基酸处，是将144位点的缬氨酸突变为甘氨酸。
[0009]另外，本专利技术也可以在野生型玉米赤霉烯酮降解酶的基础上，进行N156H和V144G两处定点突变，从而获得了一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体。因此，本专利技术还保护一种突变位点在提高野生型玉米赤霉烯酮降解酶的比酶活中的应用，所述的野生型玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如有SEQ ID NO.5所示，所述突变位点位于所述野生型玉米赤霉烯酮降解酶的144和156氨基酸处，是将144位点的缬氨酸突变为甘氨酸，156位点的天冬酰胺突变为组氨酸。
[0010]一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体，该降解酶具有序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或该降解酶是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的保守性变异体。
[0011]需要说明的是，本专利技术所提供的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体是一种内酯水解酶。SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列由266个氨基酸残基组成，主要是将中性玉米赤霉烯酮降解酶Zhd518突变体1M的第144位点的缬氨酸VAL突变成甘氨酸GLY，所得突变体是Zhd518(N156H/V144G)，命名为2M。
[0012]为了使上述降解酶突变体蛋白质便于纯化，可在上述氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0013]表1标签的序列
[0014][0015][0016]上述降解酶突变体蛋白质可以人工合成，也可通过在野生型中性玉米赤霉烯酮降解酶Zhd518(CN107099520A)或突变体1M的基础上定点突变的方法获得含有编码基因的载体，再进行生物表达得到。上述中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体的编码基因还可通过将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中，缺失、置换、插入或添加一个至几个并保持原有酶活性，或者连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0017]另外，本专利技术还提供了一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体的编码基因，该基因编码：
[0018](a)具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质；
[0019](b)具有衍生自缺失、置换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的SEQ ID NO.1所示
的氨基酸序列并具有玉米赤霉烯酮降解活性的蛋白质。
[0020]进一步，所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体的编码基因为(i)、(ii)或(iii)的DNA分子：
[0021](i)具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的DNA分子；
[0022](ii)在严格条件下与(i)所述的核苷酸序列杂交且编码具有玉米赤霉烯酮降解活性的蛋白质的DNA分子；
[0023](iii)与(i)或(ii)所述的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的DNA分子。
[0024]进一步，所述严格条件为钠浓度50
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300mM的溶液中，反应温度50
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68℃。
[0025]本专利技术还提供一种重组载体，该重组载体包含上述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体的编码基因。具体的，所述重组载体为上述任一所述编码基因插入出发载体(例如：pET28a)的多克隆位点得到的重组表达载体。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变位点在提高玉米赤霉烯酮降解酶突变体1M的比酶活中的应用，所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体1M的氨基酸序列如有SEQ ID NO.6所示，所述突变位点位于所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体1M的144氨基酸处，是将144位点的缬氨酸突变为甘氨酸。2.一种突变位点在提高野生型玉米赤霉烯酮降解酶的比酶活中的应用，所述的野生型玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如有SEQ ID NO.5所示，所述突变位点位于所述野生型玉米赤霉烯酮降解酶的144和156氨基酸处，是将144位点的缬氨酸突变为甘氨酸，156位点的天冬酰胺突变为组氨酸。3.一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体，其特征在于，该降解酶突变体具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或该降解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的保守性变异体。4.一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体的编码基因，其特征在于，该基因编码：(a)具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)具有衍生自缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列并具有降解玉米赤霉烯酮的活性的蛋白质。5.根据权利要求4所述比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张桂敏，王美星，李佳维，李晓迪，巫攀，袁其朋，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：