一种重组酯酶、基因、重组菌及降解邻苯二甲酸酯的应用制造技术

本发明专利技术适用于酶工程技术领域，提供了一种重组酶酯、基因、重组菌及降解邻苯二甲酸酯的应用，重组酶酯的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。该重组酶酯其低温稳定性好，可以作为生物酶制剂的活性组分，对PAEs包括DMP、DEP、DPrP、DBP、BBP和DPP有强降解作用，因此在去除PAEs残留方面有广阔的应用前景。留方面有广阔的应用前景。留方面有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种重组酯酶、基因、重组菌及降解邻苯二甲酸酯的应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，尤其涉及一种重组酯酶、基因、重组菌及降解邻苯二甲酸酯的应用。

技术介绍

[0002]邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类新型持久性环境污染物的总称，在塑料生产中广泛用作增塑剂和软化剂，以提高弹性和柔韧性，PAEs还用于建筑材料、医疗器械、电线电缆和其他行业。由于PAEs与塑料以非共价键的形式结合，所以它们很容易从聚合物中释放渗透到周围环境中，污染环境。美国环境保护署(EPA)、欧盟和中国国家环境监测中心将多种PAEs列为优先控制污染物。因此，在自然分解能力无法满足人类安全需求的形势下，寻找高效降解PAEs的新方法，降低PAEs的毒负作用已成为一个重要研究领域。
[0003]生物法尤其是生物酶在处理PAEs残留问题上具有处理简便、安全高效、应用范围广且无二次污染等优点，日益受到重视。因此，急需具有优良性能的生物催化剂PAEs降解酶。

技术实现思路

[0004]本专利技术实施例的目的在于提供一种重组酶酯，旨在解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]本专利技术的酶酯基因是从毛豆腐中克隆所得到的，以毛豆腐为样本构建宏基因组文库，酯酶基因能够分解酯酶平板筛选上三丁酸甘油酯形成透明圈，提取含有酯酶基因的菌落进行测序，确定酯酶基因，设计引物对上面所筛选到的基因进行特异性扩增，获取酯酶基因，以pET为载体在大肠杆菌中异源表达，能够水解邻苯二甲酸酯的酶可在邻苯二甲酸酯筛选平板上形成透明圈，通过实验获得能够分解邻苯二甲酸酯的酯酶基因，命名为est1260。
[0006]本专利技术实施例是这样实现的，一种重组酶酯Est1260，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术实施例还提供了一种酶酯基因est1260，编码所述的重组酶酯Est1260，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术实施例还提供了一种酶酯基因est1260构建的重组载体，所述重组载体的表达载体为pET
‑
32a(+)。
[0009]本专利技术实施例还提供了一种重组载体转化制备的重组菌。
[0010]作为本专利技术实施例的一个优选方案，将表达载体pET
‑
32a(+)和酶酯基因est1260经BamH I和HindⅢ双酶切后连接，并转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组菌。
[0011]本专利技术实施例还提供了一种制备重组酶酯Est1260的方法，包括以下步骤：
[0012]用所述的表达载体转化宿主细胞，得到重组菌；
[0013]经IPTG诱导，得到重组酯酶Est1260。
[0014]作为本专利技术实施例的一个优选方案，所述IPTG终浓度为10
‑
1000μM，诱导温度为16
～30℃。
[0015]本专利技术实施例还提供了一种重组酶酯Est1260在降解邻苯二甲酸酯上的应用。
[0016]作为本专利技术实施例的一个优选方案，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基卞酯或邻苯二甲酸二戊酯。
[0017]作为本专利技术实施例的一个优选方案，所述降解温度为0
‑
40℃；降解时的pH为6.47
‑
9.18。
[0018]本专利技术实施例提供的一种重组酶酯Est1260，其低温稳定性好，可以作为生物酶制剂的活性组分，用于降解PAEs；
[0019]将酯酶基因est1260序列进行异源表达，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下：
[0020](1)在大肠杆菌表达体系中，该重组蛋白具有高效可溶性表达；
[0021](2)用对硝基苯酚乙酸酯为底物，测得重组蛋白的最适反应温度为35℃，在0℃仍保留70％左右的酶活性，说明此酶是一种冷适应性酯酶；在温度低于30℃非常稳定，4℃保温24h后，保留80％的相对酶活性；最适反应pH为8.5，在pH 5.0
‑
9.0下处理24h，剩余酶活性均大于80％，说明其具有较好的酸碱耐受性。
[0022]重组酯酶Est1260对PAEs包括DMP、DEP、DPrP、DBP、BBP和DPP有强降解作用，因此在去除PAEs残留方面有广阔的应用前景。
附图说明
[0023]图1为在E.coli中表达的重组酯酶Est1260的SDS
‑
PAGE分析，其中，M为标准蛋白分子量maker，1为重组蛋白粗提物，2为纯化的重组蛋白；
[0024]图2为以对硝基苯酚乙酸酯为底物重组酯酶的最适温度结果的折线图；
[0025]图3为以对硝基苯酚乙酸酯为底物重组酯酶的热稳定性结果的折线图；
[0026]图4为以对硝基苯酚乙酸酯为底物重组酯酶的最适pH结果的折线图；
[0027]图5为以对硝基苯酚乙酸酯为底物重组酯酶的pH稳定性结果的折线图；
[0028]图6为重组酶酯对底物DMP、DEP、DPrP、DBP、BBP和DPP降解液相色谱图。
具体实施方式
[0029]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0030]以下结合具体实施例对本专利技术的具体实现进行详细描述。
[0031]实施例1
[0032]酯酶基因的克隆与大肠杆菌表达
[0033]1、基因片段的克隆
[0034]根据酯酶基因est1260的基因序列设计引物如下：
[0035]est1260
‑
F
’
:5'
‑
TTATTGGATCCATGATGCCCGGAGCGGCAAC
‑
3'(如序列表SEQ ID NO.3所示)；
[0036]est1260
‑
R
’
:5'
‑
ATTAAGCTTTCATCGCGTTGCCCCCAGGTCG
‑
3'(如序列表SEQ ID NO.4所示)。
[0037]以质粒pUC118
‑
est1260为模板、est1260
‑
F
’
和est1260
‑
R
’
为引物，对est1260基因进行PCR扩增，体系如下：
[0038][0039]PCR反应条件如下：预变性：98℃，5min；变性：98℃，30s，退火：63℃，10s，延伸：72℃，10s；其中，重复变性
‑
退火
‑
延伸过程30个循环；再延伸：72℃，10min。PCR扩增结束后，取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余部分放于
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组酶酯Est1260，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。2.一种酶酯基因est1260，编码权利要求1所述的重组酶酯Est1260，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。3.一种如权利要求2所述的酶酯基因est1260构建的重组载体，其特征在于，所述重组载体的表达载体为pET
‑
32a(+)。4.一种如权利要求3所述的重组载体转化制备的重组菌。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，是将表达载体pET
‑
32a(+)和酶酯基因est1260经BamH I和HindⅢ双酶切后连接，并转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，获得重组菌。6.一种制备重组酶酯Est1260的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：范新炯，刘艳艳，赵萌，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：