一株产异黄酮类成分的黄芪内生细菌及其应用制造技术

一株产异黄酮类成分的黄芪内生细菌及其应用，涉及一株黄芪内生细菌及其应用。是要解决现有从植物中提取毛蕊异黄酮及芒柄花素的方法存在浪费药用植物资源的问题。芪内生细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HHQX8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年11月08日，保藏编号为CCTCC NO：M20211384。黄芪内生细菌HHQX8的次生代谢物中含有毛蕊异黄酮及芒柄花素，具有较好的抗氧化活性。本发明专利技术应用于生物发酵法生产黄芪异黄酮类化合物。明应用于生物发酵法生产黄芪异黄酮类化合物。明应用于生物发酵法生产黄芪异黄酮类化合物。

【技术实现步骤摘要】
一株产异黄酮类成分的黄芪内生细菌及其应用


[0001]本专利技术涉及一株黄芪内生细菌及其应用。

技术介绍

[0002]黄芪为豆科植物蒙古黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.Mongholicus(Bge.)Hsiao)或膜荚黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)的干燥根，全世界共存在11亚属，其中有8亚属存在于中国，大多分布在中国的东北、西北和华北地区，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌的功效，在《神农本草经》中就已将其列为上品，且具有高效、低毒的特性，在医疗保健方面具有不可或缺的作用，具有广泛的开发前景。
[0003]研究表明，黄芪含有皂苷、多糖、黄酮、核黄素、叶酸、香豆素、生物碱、多种氨基酸、有机酸、微量元素等化学成分。其中皂苷类成分黄芪甲苷及黄酮类成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷为《中国药典》2020版黄芪含量测定项下的指标成分。
[0004]黄芪具有广泛的药理作用，临床上用于治疗肾炎、糖尿病、蛋白尿、高血压、肝硬化和癌症等疾病。毛蕊异黄酮和芒柄花素作为黄芪的主要异黄酮类苷元，已被证实具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、降低血糖等作用，因此，黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素的高效生产在食品和医药领域具有重要意义。
[0005]目前，关于毛蕊异黄酮及芒柄花素的生产，大多采用柱色谱等分离技术从药用植物中进行提取分离，但这样的分离工艺不仅浪费药用植物资源，且不利于工业化生产。
专利技术内容
[0006]本专利技术是要解决现有从植物中提取毛蕊异黄酮及芒柄花素的方法存在浪费药用植物资源的问题，提供一株产异黄酮类成分的黄芪内生细菌及其应用。
[0007]本专利技术提供一株黄芪内生细菌，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HHQX8，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2021年11月08日，保藏编号为CCTCC NO：M20211384。
[0008]本专利技术枯草芽孢杆菌HHQX8的细胞形态为杆状，有鞭毛，菌落形态为圆形，菌落颜色为乳白色，革兰氏染色呈阳性，有菌膜形成。
[0009]本专利技术枯草芽孢杆菌HHQX8的淀粉水解反应、明胶液化试验、接触酶试验、油脂水解实验、G
+
/G
‑
、甲基红试验、运动性试验、V.P试验、硝酸盐还原试验均呈阳性。
[0010]本专利技术枯草芽孢杆菌HHQX8为好氧菌，最适生长温度为37℃，最适盐浓度为4％NaCl，最适生长pH值为7.0，对数生长期为10～20h。
[0011]本专利技术枯草芽孢杆菌HHQX8通过16S rDNA序列比对分析，与Bacillus subtilis MON6(MG833866)聚于同一分支，且两者同源性为95％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化特征和分子鉴定结果确定，本专利技术的菌株HHQX8属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
[0012]本专利技术还提供枯草芽孢杆菌HHQX8在发酵产黄芪异黄酮类化合物中的应用。
[0013]进一步的，所述黄芪异黄酮类化合物为毛蕊异黄酮和芒柄花素。
[0014]进一步的，黄芪异黄酮类化合物的提取方法为：
[0015]取枯草芽孢杆菌HHQX8发酵液，离心除去菌体，上清液通过D
101
大孔吸附树脂柱洗脱后，依次以不同浓度乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇，再通过聚酰胺柱，采用氯仿/甲醇洗脱，按10mL/瓶收集洗脱液，随行采用TLC法进行跟踪检测，合并含有黄芪异黄酮类成分的洗脱液，回收溶剂后，采用硅胶柱色谱分离，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，收集石油醚/乙酸乙酯洗脱液X，经TLC法进行跟踪检测，合并含有黄芪异黄酮类成分的洗脱液，重结晶处理，纯化得到芒柄花素；继续收集石油醚/乙酸乙酯洗脱液Y，合并含有黄芪异黄酮类成分的洗脱液，多次重结晶，纯化得到毛蕊异黄酮。
[0016]进一步的，所述不同浓度乙醇为体积浓度依次为30％、50％、70％和90％的乙醇溶液。
[0017]进一步的，石油醚/乙酸乙酯洗脱液X中石油醚:乙酸乙酯为10:1。
[0018]进一步的，石油醚/乙酸乙酯洗脱液Y中石油醚:乙酸乙酯为1:1。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020]本专利技术中黄芪内生细菌HHQX8的次生代谢物中含有毛蕊异黄酮及芒柄花素，具有较好的抗氧化活性。
[0021]本专利技术可以通过发酵黄芪内生细菌HHQX8来产毛蕊异黄酮和芒柄花素，纯度较高，芒柄花素的纯度可达98.63％，毛蕊异黄酮的纯度可达99.84％。本专利技术避免了浪费药用植物资源，且利于工业化生产。
[0022]本专利技术为采用微生物发酵法生产黄芪异黄酮类化合物提供新方法。
附图说明
[0023]图1为黄芪内生细菌HHQX8的菌落形态；
[0024]图2为黄芪内生细菌HHQX8的显微形态；
[0025]图3为黄芪内生细菌HHQX8的系统发育树；
[0026]图4为黄芪内生细菌HHQX8对DPPH自由基的清除能力；
[0027]图5为黄芪内生细菌HHQX8对
·
OH自由基的清除能力；
[0028]图6为黄芪内生细菌HHQX8发酵液次生代谢产物分析结果；
[0029]图7为化合物A的高效液相色谱图；
[0030]图8为化合物A与芒柄花素混合的高效液相色谱图；
[0031]图9为化合物B的高效液相色谱图；
[0032]图10为化合物B与毛蕊异黄酮混合的高效液相色谱图
具体实施方式
[0033]下面对本专利技术的实施例做详细说明，以下实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。
[0034]实施例1：
[0035]本实施例黄芪内生细菌，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HHQX8，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2021年11月08日，保藏编号为CCTCC NO：M20211384。
[0036]实施例2：本实施例黄芪内生细菌HHQX8的获取方法为：
[0037]选取健康膜荚黄芪根(膜荚黄芪选自黑龙江省林口县百里黄芪谷的健康膜荚黄芪)，冲洗干净，放置阴干，切成5cm小段，置于75％酒精中浸泡1min，然后置于5％NaClO中漂洗10min，接着用75％酒精浸泡1min，最后以无菌水冲洗3次后作为消毒后的实验材料；取最后一次无菌水冲洗液涂布培养平板或取适量此冲洗液倒入NA培养基内作对照，另外在相同条件下，将消毒之后的实验材料于培养平板上滚动培养一周，作为对照。
[0038]将消毒后的实验材料两端用无菌手术刀各切1cm，使木质部与韧皮部分离，置于NA培养基中，于37℃温培养箱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产异黄酮类成分的黄芪内生细菌，其特征在于所述黄芪内生细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HHQX8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2021年11月08日，保藏编号为CCTCC NO：M20211384。2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HHQX8在发酵产黄芪异黄酮类化合物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述黄芪异黄酮类化合物为毛蕊异黄酮和芒柄花素。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述黄芪异黄酮类化合物的提取方法为：取枯草芽孢杆菌HHQX8发酵液，离心除去菌体，上清液通过D
101
大孔吸附树脂柱洗脱后，依次以不同浓度乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇，再通过聚酰胺柱，采用氯仿/...

【专利技术属性】
技术研发人员：董行，
申请(专利权)人：黑龙江龙九堂药业有限公司，
类型：发明
国别省市：