一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法及其应用，所述方法包括以下步骤(1)、深海耐盐菌的富集；(1.1)、培养基配制；(1.2)、混合菌液的富集：取深海底泥样品加入到培养基中培养5天，然后以10％的接种量(v/v)转接至新鲜的经同样处理的培养基中，连续富集培养四次；检测第五代富集液中菌种的浓度；当第五代培养液在培养5天后菌浓度大于1

【技术实现步骤摘要】
一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物降解
，具体涉及一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法及其应用。

技术介绍

[0002]苯酚属于一种常见的酚类物质，广泛应用于杀菌剂、树脂、石油和药品等生产过程中，含酚废水的排放不仅对环境造成严重的污染，还会危害到动、植物以及人类的健康。人类长期饮用被苯酚污染过的水或食物，会损害肝、肾功能，甚至导致死亡。因此，该类废水具有来源广、水量多、危害大和盐度高的特点。
[0003]作为一种需要被优先控制的污染物，含酚废水的处理方法主要分为物理法、化学法和生物法。其中生物法以其经济、高效和无二次污染等优点，受到越来越多的关注。目前科学家们已经筛选出多种苯酚降解菌，主要有芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)和红球菌属(Rhodococcus sp.)等，但废水中较高的盐度严重制约了这些微生物降解苯酚的能力。因此，研究既可以高效降解苯酚又可以耐受高盐度的微生物仍然是国内外学者工作的重点。
[0004]海洋微生物的生存环境与陆生的微生物存在着巨大差异，海洋环境的特殊性造就了海洋微生物的多样性和特异性。由于海洋环境有高盐、高压、低温、寡营养、低光照(甚至无光照)等特征，海洋微生物长期适应复杂的海洋环境而生存，因而具备嗜盐、嗜压、嗜冷、低营养性、趋化性与附着生长、多形性、发光性等独特性状，使其在环境修复领域中具有很大的应用潜力。因此，从深海极端环境中筛选出耐盐且高效降解苯酚的微生物菌种将为高盐有机工业废水的处理提供一种的可行性思路。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的问题是：提供一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法及其应用，能够解决高盐环境下微生物难降解苯酚的问题。
[0006]本专利技术为解决上述问题所提供的技术方案为：一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法，所述方法包括以下步骤
[0007](1)、深海耐盐菌的富集；
[0008](1.1)、培养基配制；
[0009](1.2)、混合菌液的富集：取深海底泥样品加入到培养基中培养5天，然后以10％的接种量(v/v)转接至新鲜的经同样处理的培养基中，连续富集培养四次；检测第五代富集液中菌种的浓度；当第五代培养液在培养5天后菌浓度大于1
×
109个/mL时，富集培养结束，得到富集培养菌液；
[0010](2)、混合菌种耐盐能力驯化：将上述富集培养菌液进行驯化培养，采用逐步提高驯化培养的培养基中NaCl浓度的方法对富集培养菌液的耐盐能力进行梯度驯化。
[0011]优选的，所述步骤(1)中培养基的配方为将以下重量份数配比的组分：蛋白胨5份、
酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、NaCl 19.45份、MgCl
2 5.98份、Na2SO
4 3.24份、CaCl
2 1.8份、KCl 0.55份、Na2CO
3 0.16份、KBr 0.08份、SrCl
2 0.034份、H3BO
3 0.022份、Na2SiO
3 0.04份、NaF 0.0024份、NH4NO
3 0.0016份、Na2HPO
4 0.008份加热溶解于蒸馏水中高压灭菌。
[0012]优选的，高压灭菌的条件为自然pH，温度为121℃，时间为15分钟。
[0013]优选的，所述步骤(1.2)中培养的条件为30℃、150rpm摇床培养5天。
[0014]优选的，所述步骤(1.2)中检测第五代富集液中菌种的浓度的方法具体包括
[0015](1.2.1)、菌浓标准曲线的制作
[0016]用血细胞计数板计数培养24小时的菌悬液，取1mL的菌悬液放入离心机，在3000rpm下离心5min，然后再将上清液转入另一个干净的1.5mL的离心管中，再在10000rpm下离心5min，倒掉上清液，并用无菌水分别稀释调整浓度到每毫升的含菌量为3.2
×
108、1.6
×
108、8
×
107、4
×
107、2
×
107和1
×
107，然后测定于660nm波长处各管的OD值，此时用无菌水做空白对照，最后以OD值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制出菌浓标准曲线；
[0017](1.2.2)、实际菌浓的测定
[0018]取1mL实际菌样，在3000rpm下离心5min，然后再将上清液转入另一个干净的1.5mL的离心管中，再在10000rpm下离心5min，倒掉上清液，用1mL无菌水去冲离心管底的菌团，并涡旋3min，测定此时的OD
600
值，通过菌浓标准曲线计算得到其菌浓。
[0019]优选的，所述步骤(2)中驯化培养的培养基中，NaCl的浓度调整为0％
‑
12％，具体可以为0％，2％，4％，6％，8％，10％，12％，或上述任意两个值之间的任意数值。
[0020]优选的，所述步骤(2)中驯化培养的条件包括温度为28
‑
30℃、转速为120
‑
150r/min、培养时间为5
‑
7天，而后测定培养基中菌种浓度，以确定菌种是否能够耐受该设置下的盐浓度，每组实验设置三次重复。
[0021]优选的，所述步骤(2)中驯化培养的培养基中，除NaCl外，还包括以下质量份数的组分：蛋白胨5份、酵母浸粉1份，加热溶解于蒸馏水中，自然pH，121℃高压灭菌15分钟，备用。
[0022]本专利技术的另一目的在于提供一种通过如上述任意一项选育方法选育得到的深海耐盐苯酚降解菌在高盐有机工业废水中的应用。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的优点是：本专利技术选育得到的深海耐盐苯酚降解菌具有盐度适应范围广、耐盐含量高、苯酚降解能力强及降解速率快等优点，在高盐苯酚废水生物处理中具有较大的应用潜力。
附图说明
[0024]此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0025]图1是本专利技术菌浓标准曲线图；
[0026]图2是本专利技术菌种对NaCl的最大耐受能力示意图；
[0027]图3是本专利技术苯酚标准曲线图；
[0028]图4是本专利技术菌种对不同浓度苯酚的降解图；
[0029]图5是本专利技术深海耐盐菌驯化培养液的属水平物种丰度占比图；
[0030]图6是本专利技术深海耐盐菌群对实际废水的处理效果图。
具体实施方式
[0031]以下将配合附图及实施例来详细说明本专利技术的实施方式，借此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0032]应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤(1)、深海耐盐菌的富集；(1.1)、培养基配制；(1.2)、混合菌液的富集：取深海底泥样品加入到培养基中培养5天，然后以10％的接种量(v/v)转接至新鲜的经同样处理的培养基中，连续富集培养四次；检测第五代富集液中菌种的浓度；当第五代培养液在培养5天后菌浓度大于1
×
109个/mL时，富集培养结束，得到富集培养菌液；(2)、混合菌种耐盐能力驯化：将上述富集培养菌液进行驯化培养，采用逐步提高驯化培养的培养基中NaCl浓度的方法对富集培养菌液的耐盐能力进行梯度驯化。2.根据权利要求1所述的一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法，其特征在于：所述步骤(1)中培养基的配方为将以下重量份数配比的组分：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、NaCl 19.45份、MgCl
2 5.98份、Na2SO
4 3.24份、CaCl
2 1.8份、KCl 0.55份、Na2CO
3 0.16份、KBr 0.08份、SrCl
2 0.034份、H3BO
3 0.022份、Na2SiO
3 0.04份、NaF 0.0024份、NH4NO30.0016份、Na2HPO
4 0.008份加热溶解于蒸馏水中高压灭菌。3.根据权利要求2所述的一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法，其特征在于：高压灭菌的条件为自然pH，温度为121℃，时间为15分钟。4.根据权利要求2所述的一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法，其特征在于：所述步骤(1.2)中培养的条件为30℃、150rpm摇床培养5天。5.根据权利要求1所述的一种深海耐盐苯酚降解菌的选育方法，其特征在于：所述步骤(1.2)中检测第五代富集液中菌种的浓度的方法具体包括(1.2.1)、菌浓标准曲线的制作用血细胞计数板计数培养24小时的菌悬液，取1mL的菌悬液放入离心机，在3000rpm下离心5min，然后再将上清液转入另一个干净的1.5mL的离心管中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹建平，侯冬梅，李梦玲，吉瑞麟，
申请(专利权)人：南昌航空大学，
类型：发明
国别省市：